تباين ألياف العضلات الهيكلية البشرية يتجاوز سلسلة الميوسين الثقيلة

نشكركم على زيارة موقع nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام أحدث إصدار من المتصفح (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). بالإضافة إلى ذلك، ولضمان استمرار الدعم، سيظل هذا الموقع خاليًا من أنماط CSS وجافا سكريبت.
العضلات الهيكلية نسيج غير متجانس يتكون في الغالب من ألياف عضلية، تُصنف عادةً في البشر إلى ثلاثة أنواع: نوع واحد "بطيء" (النوع 1) ونوعان "سريعان" (النوعان 2A و2X). مع ذلك، لا يزال التباين بين أنواع الألياف العضلية التقليدية وداخلها غير مفهوم بشكل كافٍ. طبقنا مناهج تحليل النسخ والبروتينات على 1050 و1038 ليفًا عضليًا فرديًا من العضلة المتسعة الوحشية البشرية، على التوالي. شملت دراسة البروتينات رجالًا، بينما شملت دراسة النسخ 10 رجال وامرأتين. بالإضافة إلى نظائر السلسلة الثقيلة للميوسين، حددنا بروتينات أيضية، وبروتينات ريبوسومية، وبروتينات وصلات خلوية كمصادر للتباين متعدد الأبعاد بين الألياف العضلية. علاوة على ذلك، على الرغم من تحديد مجموعات من الألياف البطيئة والسريعة، تشير بياناتنا إلى أن ألياف النوع 2X لا يمكن تمييزها ظاهريًا عن ألياف الانقباض السريع الأخرى. علاوة على ذلك، فإن التصنيف القائم على السلسلة الثقيلة للميوسين غير كافٍ لوصف النمط الظاهري للألياف العضلية في اعتلالات العضلات الخيطية. وبشكل عام، تشير بياناتنا إلى تباين متعدد الأبعاد في الألياف العضلية، مع وجود مصادر للتباين تتجاوز أشكال السلسلة الثقيلة للميوسين.
يُعدّ التباين الخلوي سمةً متأصلةً في جميع الأنظمة البيولوجية، مما يسمح للخلايا بالتخصص لتلبية الاحتياجات المختلفة للأنسجة والخلايا.¹ كان يُنظر تقليديًا إلى تباين ألياف العضلات الهيكلية على أنه يتمثل في أن الخلايا العصبية الحركية تُحدد نوع الألياف داخل الوحدة الحركية، وأن نوع الألياف (أي النوع 1، والنوع 2A، والنوع 2X في البشر) يتحدد بخصائص نظائر سلسلة الميوسين الثقيلة (MYH).² استند هذا في البداية إلى عدم استقرارها في إنزيم ATPase الخاص بدرجة الحموضة،^3،4 ولاحقًا إلى تعبيرها الجزيئي عن MYH.⁵ ومع ذلك، مع تحديد الألياف "المختلطة" التي تُعبر عن أنواع متعددة من MYH بنسب متفاوتة، وقبولها لاحقًا، يُنظر إلى ألياف العضلات الهيكلية بشكل متزايد على أنها سلسلة متصلة وليست أنواعًا متميزة من الألياف.⁶ على الرغم من ذلك، لا يزال هذا المجال يعتمد بشكل كبير على MYH كمُصنِّف أساسي لتصنيف ألياف العضلات، وهو رأي من المحتمل أن يكون قد تأثر بالقيود والتحيزات الكبيرة للدراسات المبكرة على القوارض، والتي تختلف فيها أنماط التعبير عن MYH ونطاق أنواع الألياف عن تلك الموجودة في الدراسات السابقة. تلك الموجودة لدى البشر.2 ويزداد الوضع تعقيدًا نظرًا لأن عضلات الهيكل العظمي البشري المختلفة تُظهر نطاقًا متنوعًا من أنواع الألياف.7 تُعد العضلة المتسعة الوحشية عضلة مختلطة ذات نمط تعبير جيني متوسط ​​(وبالتالي نموذجي) لجين MYH.7 علاوة على ذلك، فإن سهولة أخذ عينات منها تجعلها العضلة الأكثر دراسة لدى البشر.
لذا، يُعدّ إجراء دراسة موضوعية لتنوع ألياف العضلات الهيكلية باستخدام أدوات "الأوميكس" القوية أمرًا بالغ الأهمية، ولكنه في الوقت نفسه يُمثّل تحديًا، ويعود ذلك جزئيًا إلى طبيعة ألياف العضلات الهيكلية متعددة النوى. مع ذلك، شهدت تقنيات علم النسخ (transcmentomics) وعلم البروتينات (proteomics) ثورةً في حساسيتها خلال السنوات الأخيرة بفضل العديد من التطورات التقنية، مما أتاح تحليل العضلات الهيكلية بدقة تصل إلى مستوى الليف الواحد. ونتيجةً لذلك، أُحرز تقدم ملحوظ في توصيف تنوع الألياف المفردة واستجابتها لمحفزات الضمور والشيخوخة. والأهم من ذلك، أن لهذه التطورات التقنية تطبيقات سريرية، إذ تُتيح توصيفًا أكثر تفصيلًا ودقةً للاضطرابات المرتبطة بالأمراض. على سبيل المثال، فإن الفيزيولوجيا المرضية لاعتلال العضلات الخيطي، وهو أحد أكثر أمراض العضلات الوراثية شيوعًا (MIM 605355 وMIM 161800)، معقدة ومربكة.19،20 لذلك، فإن تحسين توصيف خلل تنظيم ألياف العضلات الهيكلية يمكن أن يؤدي إلى تقدم كبير في فهمنا لهذا المرض.
لقد طورنا أساليب لتحليل النسخ الجيني والبروتيني لألياف العضلات الهيكلية المفردة المعزولة يدويًا من عينات خزعة بشرية، وطبقناها على آلاف الألياف، مما أتاح لنا دراسة التباين الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية البشرية. وخلال هذا العمل، أثبتنا فعالية التنميط الظاهري للنسخ الجيني والبروتيني لألياف العضلات، وحددنا البروتينات الأيضية والريبوسومية والبروتينات الرابطة الخلوية كمصادر مهمة للتباين بين الألياف. علاوة على ذلك، وباستخدام منهجية التحليل البروتيني هذه، وصفنا الأهمية السريرية لاعتلال العضلات الناتج عن الديدان الأسطوانية في ألياف العضلات الهيكلية المفردة، وكشفنا عن تحول منسق نحو ألياف غير مؤكسدة بغض النظر عن نوع الألياف بناءً على جين MYH.
لدراسة تباين ألياف العضلات الهيكلية البشرية، طورنا منهجين لتحليل النسخ الجيني والبروتينات في ألياف العضلات الهيكلية المفردة (الشكل 1أ والشكل التكميلي 1أ). وقد طورنا وحسّنا عدة خطوات منهجية، بدءًا من تخزين العينات والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبوزي والبروتينات، وصولًا إلى تحسين الإنتاجية لكل منهج. بالنسبة لتحليل النسخ الجيني، تم ذلك بإدخال رموز شريطية جزيئية خاصة بكل عينة في الخطوة الأولى من النسخ العكسي، مما سمح بتجميع 96 ليفًا لمعالجة لاحقة فعالة. وقد أدى التسلسل الأعمق (حوالي مليون قراءة لكل ليف) مقارنةً بالأساليب التقليدية للخلايا المفردة إلى إثراء بيانات النسخ الجيني بشكل أكبر.²¹ أما بالنسبة لتحليل البروتينات، فقد استخدمنا تدرجًا كروماتوغرافيًا قصيرًا (21 دقيقة) مع تقنية DIA-PASEF لاكتساب البيانات على مطياف الكتلة timsTOF لتحسين عمق تحليل البروتينات مع الحفاظ على إنتاجية عالية. 22، 23 للتحقق من تباين ألياف العضلات الهيكلية السليمة، قمنا بتحليل التعبير الجيني لـ 1050 ليفًا عضليًا فرديًا من 14 متبرعًا بالغًا سليمًا، وتحليل البروتينات لـ 1038 ليفًا عضليًا من 5 متبرعين بالغين أصحاء (الجدول التكميلي 1). في هذه الورقة، يُشار إلى مجموعتي البيانات هاتين باسمي التعبير الجيني والبروتيني لـ 1000 ليف، على التوالي. كشف منهجنا عن 27237 نسخة جينية و2983 بروتينًا في تحليلات التعبير الجيني والبروتيني لـ 1000 ليف (الشكل 1أ، مجموعتا البيانات التكميليتان 1-2). بعد ترشيح مجموعتي بيانات التعبير الجيني والبروتيني بحيث تحتوي كل منهما على أكثر من 1000 جين مكتشف و50% من القيم الصحيحة لكل ليف، أُجريت تحليلات المعلوماتية الحيوية اللاحقة على 925 و974 ليفًا في التعبير الجيني والبروتيني، على التوالي. بعد عملية الترشيح، تم الكشف عن متوسط ​​4257 ± 1557 جينًا و2015 ± 234 بروتينًا (المتوسط ​​± الانحراف المعياري) لكل ليف عضلي، مع تباين محدود بين الأفراد (الشكلان التكميليان 1ب-ج، ومجموعتا البيانات التكميليتان 3-4). مع ذلك، كان التباين داخل الفرد الواحد أكثر وضوحًا بين المشاركين، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الاختلافات في كمية الحمض النووي الريبوزي/البروتين بين الألياف ذات الأطوال ومساحات المقطع العرضي المختلفة. بالنسبة لمعظم البروتينات (أكثر من 2000)، كان معامل التباين أقل من 20% (الشكل التكميلي 1د). سمحت كلتا الطريقتين بالتقاط نطاق ديناميكي واسع من النسخ والبروتينات ذات البصمات عالية التعبير المهمة لانقباض العضلات (مثل ACTA1 وMYH2 وMYH7 وTNNT1 وTNNT3) (الشكلان التكميليان 1هـ-و). كانت معظم السمات المحددة مشتركة بين مجموعات بيانات النسخ والبروتينات (الشكل التكميلي 1G)، وكانت متوسطات شدة UMI/LFQ لهذه السمات مرتبطة بشكل جيد إلى حد معقول (r = 0.52) (الشكل التكميلي 1H).
سير عمل علم النسخ وعلم البروتينات (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com). BD: منحنيات النطاق الديناميكي لـ MYH7 وMYH2 وMYH1، والعتبات المحسوبة لتحديد نوع الألياف. E، F: توزيع تعبير MYH عبر الألياف في مجموعات بيانات علم النسخ وعلم البروتينات. G، H: مخططات تقريب التنوع الموحد والإسقاط (UMAP) لعلم النسخ وعلم البروتينات، مُلوّنة حسب نوع الألياف بناءً على MYH. I، J: مخططات الميزات التي تُظهر تعبير MYH7 وMYH2 وMYH1 في مجموعات بيانات علم النسخ وعلم البروتينات.
بدأنا في البداية بتحديد نوع الألياف لكل ليف باستخدام منهجية مُحسَّنة تستفيد من الحساسية العالية والنطاق الديناميكي الواسع لتعبير جينات MYH في مجموعات بيانات علم الجينوم الوظيفي. استخدمت دراسات سابقة عتبات اعتباطية لتصنيف الألياف إلى النوع 1 النقي، والنوع 2A، والنوع 2X، أو مختلط، بناءً على نسبة ثابتة من تعبير جينات MYH المختلفة^11،14،24. اتبعنا منهجية مختلفة، حيث رُتِّب تعبير كل ليف وفقًا لجينات MYH التي استخدمناها لتصنيف الألياف: MYH7، وMYH2، وMYH1، والتي تُقابل ألياف النوع 1، والنوع 2A، والنوع 2X على التوالي. ثم حسبنا رياضيًا نقطة الانعطاف الدنيا لكل منحنى ناتج، واستخدمناها كعتبة لتصنيف الألياف إلى موجبة (أعلى من العتبة) أو سالبة (أقل من العتبة) لكل جين MYH (الشكل 1B-D). تُظهر هذه البيانات أنَّ MYH7 (الشكل 1ب) وMYH2 (الشكل 1ج) يتميزان بأنماط تعبير جيني أكثر وضوحًا على مستوى الحمض النووي الريبوزي (RNA) مقارنةً بمستوى البروتين. في الواقع، على مستوى البروتين، لم تُظهر سوى ألياف قليلة جدًا تعبيرًا عن MYH7، ولم تُظهر أي ألياف تعبيرًا كاملًا عن MYH2. بعد ذلك، استخدمنا عتبات تعبير مُحددة مسبقًا لتصنيف أنواع الألياف المُعتمدة على MYH لجميع الألياف في كل مجموعة بيانات. على سبيل المثال، صُنفت ألياف MYH7+/MYH2-/MYH1- ضمن النوع 1، بينما صُنفت ألياف MYH7-/MYH2+/MYH1+ ضمن النوع المختلط 2A/2X (انظر الجدول التكميلي 2 للاطلاع على الوصف الكامل). عند تجميع جميع الألياف، لاحظنا توزيعًا متشابهًا بشكل ملحوظ لأنواع الألياف المُعتمدة على MYH على مستوى الحمض النووي الريبوزي (الشكل 1هـ) والبروتين (الشكل 1و)، بينما اختلف التركيب النسبي لأنواع الألياف المُعتمدة على MYH بين الأفراد، كما هو متوقع (الشكل التكميلي 2أ). صُنّفت معظم الألياف إما كنوع نقي من النوع 1 (34-35%) أو النوع 2A (36-38%)، على الرغم من رصد عدد كبير من الألياف المختلطة من النوع 2A/2X (16-19%). ويكمن الاختلاف اللافت في أن ألياف النوع 2X النقية لم تُكتشف إلا على مستوى الحمض النووي الريبوزي (RNA)، وليس على مستوى البروتين، مما يشير إلى أن التعبير السريع عن جين MYH يُنظّم جزئيًا على الأقل بعد النسخ.
لقد تحققنا من صحة طريقتنا لتصنيف ألياف MYH باستخدام البروتينات، وذلك من خلال تقنية التلطيخ النقطي المعتمدة على الأجسام المضادة. وقد حققت كلتا الطريقتين توافقًا تامًا (100%) في تحديد ألياف النوع 1 النقية وألياف النوع 2A (انظر الشكل التكميلي 2B). ومع ذلك، كانت الطريقة القائمة على البروتينات أكثر حساسية وكفاءة في تحديد الألياف المختلطة، وفي تحديد نسبة كل جين MYH في كل ليف. تُظهر هذه البيانات فعالية استخدام طريقة موضوعية وحساسة للغاية تعتمد على علم الجينوم الوظيفي لتوصيف أنواع ألياف العضلات الهيكلية.
استخدمنا بعد ذلك المعلومات المُجمعة من علم النسخ وعلم البروتينات لتصنيف الألياف العضلية بموضوعية بناءً على النسخ أو البروتينات الكاملة. وباستخدام طريقة التقريب والإسقاط الموحد للمشعب (UMAP) لتقليل الأبعاد إلى ستة مكونات رئيسية (الشكلان التكميليان 3أ و3ب)، تمكّنا من تصوير تباين الألياف العضلية في النسخ (الشكل 1ز) والبروتينات (الشكل 1ح). والجدير بالذكر أن الألياف العضلية لم تُصنّف حسب المشاركين (الشكلان التكميليان 3ج و3د) أو أيام الاختبار (الشكل التكميلي 3هـ) في مجموعتي بيانات علم النسخ أو علم البروتينات، مما يشير إلى أن التباين داخل الفرد في ألياف العضلات الهيكلية أعلى من التباين بين الأفراد. في مخطط UMAP، ظهرت مجموعتان متميزتان تمثلان الألياف العضلية "السريعة" و"البطيئة" (الأشكال 1ز-1ح). تجمعت الألياف العضلية البطيئة (MYH7+) عند القطب الموجب لجين UMAP1، بينما تجمعت الألياف العضلية السريعة (MYH2+ وMYH1+) عند القطب السالب (الشكل 1I-J). مع ذلك، لم يُلاحظ أي تمييز بين أنواع الألياف سريعة الانقباض (أي النوع 2A، أو النوع 2X، أو المختلط 2A/2X) بناءً على تعبير جين MYH، مما يشير إلى أن تعبير جين MYH1 (الشكل 1I-J) أو غيره من المؤشرات الكلاسيكية للألياف العضلية 2X، مثل ACTN3 أو MYLK2 (الشكلان التكميليان 4A-B)، لا يميز بين أنواع الألياف العضلية المختلفة عند دراسة كامل النسخ الجيني أو البروتيني. علاوة على ذلك، بالمقارنة مع MYH2 وMYH7، ارتبط عدد قليل من النسخ الجينية أو البروتينات ارتباطًا إيجابيًا بـ MYH1 (الشكلان التكميليان 4C-H)، مما يشير إلى أن وفرة MYH1 لا تعكس بشكل كامل النسخ الجيني/البروتيني للألياف العضلية. تم التوصل إلى استنتاجات مماثلة عند تقييم التعبير المختلط لنظائر MYH الثلاثة على مستوى UMAP (الأشكال التكميلية 4I-J). وبالتالي، في حين يمكن تحديد ألياف 2X على مستوى النسخ بناءً على قياس MYH وحده، فإن ألياف MYH1+ لا يمكن تمييزها عن الألياف السريعة الأخرى عند النظر إلى كامل النسخ أو البروتينوم.
كخطوة أولية لاستكشاف تباين الألياف البطيئة خارج نطاق جين MYH، قمنا بتقييم أربعة بروتينات معروفة بتخصصها في أنواع الألياف البطيئة: TPM3 وTNNT1 وMYL3 وATP2A22. أظهرت الأنواع الفرعية للألياف البطيئة ارتباطات بيرسون عالية، وإن لم تكن مثالية، مع MYH7 في كل من تحليل النسخ (الشكل التكميلي 5أ) وتحليل البروتينات (الشكل التكميلي 5ب). لم يتم تصنيف ما يقارب 25% و33% من الألياف البطيئة كألياف بطيئة نقية بواسطة جميع الأنواع الفرعية للجينات/البروتينات في تحليل النسخ (الشكل التكميلي 5ج) وتحليل البروتينات (الشكل التكميلي 5د)، على التوالي. لذلك، فإن تصنيف الألياف البطيئة بناءً على أنواع فرعية متعددة من الجينات/البروتينات يُضيف تعقيدًا إضافيًا، حتى بالنسبة للبروتينات المعروفة بتخصصها في أنواع الألياف. يشير هذا إلى أن تصنيف الألياف بناءً على الأشكال المتغايرة لعائلة جينية/بروتينية واحدة قد لا يعكس بشكل كافٍ التباين الحقيقي لألياف العضلات الهيكلية.
لزيادة استكشاف التباين الظاهري لألياف العضلات الهيكلية البشرية على مستوى نموذج الأوميكس الكامل، أجرينا اختزالًا غير متحيز لأبعاد البيانات باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) (الشكل 2أ). وكما هو الحال في مخططات UMAP، لم يؤثر كل من المشارك ويوم الاختبار على تجميع الألياف على مستوى تحليل المكونات الرئيسية (الأشكال التكميلية 6أ-ج). في كلتا مجموعتي البيانات، تم تفسير نوع الألياف بناءً على MYH بواسطة المكون الرئيسي الثاني (PC2)، والذي أظهر مجموعة من ألياف النوع 1 بطيئة الانقباض ومجموعة ثانية تحتوي على ألياف النوع 2أ سريعة الانقباض، والنوع 2X، وألياف مختلطة من النوعين 2أ/2X (الشكل 2أ). في كلتا مجموعتي البيانات، ارتبطت هاتان المجموعتان بعدد قليل من الألياف المختلطة من النوعين 1/2أ. وكما هو متوقع، أكد تحليل التمثيل الزائد لمحركات المكونات الرئيسية أن المكون الرئيسي الثاني (PC2) مدفوع ببصمات انقباضية واستقلابية (الشكل 2ب والأشكال التكميلية 6د-هـ، مجموعات البيانات التكميلية 5-6). بشكل عام، وُجد أن نوع الألياف القائم على MYH كافٍ لتفسير التباين المستمر على طول PC2، باستثناء ما يسمى بألياف 2X التي تم توزيعها في جميع أنحاء النسخ الجيني داخل المجموعة السريعة.
أ. مخططات تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لمجموعات بيانات النسخ والبروتينات، مُلوّنة وفقًا لنوع الألياف بناءً على MYH. ب. تحليل إثراء مُحفزات النسخ والبروتينات في PC2 وPC1. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام حزمة clusterProfiler وقيم p المُعدّلة وفقًا لطريقة Benjamini-Hochberg. ج، د. مخططات PCA مُلوّنة وفقًا لمصطلحات علم الوجود الجيني (GO) للالتصاق بين الخلايا في النسخ ومصطلحات علم الوجود الجيني للبروتينات المُشاركة في البروتينات. تُمثل الأسهم مُحفزات النسخ والبروتينات واتجاهاتها. هـ، و. مخططات ميزات تقريب وإسقاط التشعب الموحد (UMAP) للميزات ذات الصلة سريريًا، تُظهر تدرجات التعبير المُستقلة عن نوع الألياف البطيئة/السريعة. ز، ح. الارتباطات بين مُحفزات PC2 وPC1 في النسخ والبروتينات.
على نحو غير متوقع، لم يُفسر نوع الألياف العضلية المُعتمد على جين MYH سوى ثاني أعلى درجة من التباين (PC2)، مما يُشير إلى أن عوامل بيولوجية أخرى غير مرتبطة بنوع الألياف العضلية المُعتمد على جين MYH (PC1) تلعب دورًا هامًا في تنظيم عدم تجانس ألياف العضلات الهيكلية. وكشف تحليل التمثيل الزائد لأهم العوامل المُؤثرة في PC1 أن التباين في PC1 يتحدد بشكل أساسي من خلال الالتصاق بين الخلايا ومحتوى الريبوسومات في النسخ الجيني، والكوستاميرات والبروتينات الريبوسومية في البروتينوم (الشكل 2ب والأشكال التكميلية 6د-هـ، مجموعة البيانات التكميلية 7). في العضلات الهيكلية، تربط الكوستاميرات القرص Z بالغشاء العضلي، وتشارك في نقل القوة والإشارات الخلوية. 25 كشفت مخططات PCA المشروحة باستخدام خصائص الالتصاق بين الخلايا (الترانسكريبتوم، الشكل 2C) وخصائص الكوستامير (البروتيوم، الشكل 2D) عن تحول قوي إلى اليسار في PC1، مما يشير إلى أن هذه الخصائص غنية في ألياف معينة.
أظهر فحصٌ أكثر تفصيلًا لتجمّع الألياف العضلية على مستوى UMAP أن معظم السمات أظهرت تدرجًا في التعبير الجيني قائمًا على جين MYH، مستقلًا عن نوع الألياف العضلية، بدلًا من كونه خاصًا بمجموعات فرعية محددة من الألياف العضلية. وقد لوحظ هذا التدرج في التعبير لعدة جينات مرتبطة بحالات مرضية (الشكل 2E)، مثل CHCHD10 (مرض عصبي عضلي)، وSLIT3 (ضمور عضلي)، وCTDNEP1 (مرض عضلي). كما لوحظ هذا التدرج في التعبير عبر البروتينات، بما في ذلك البروتينات المرتبطة بالاضطرابات العصبية (UGDH)، وإشارات الأنسولين (PHIP)، والنسخ (HIST1H2AB) (الشكل 2F). تشير هذه البيانات مجتمعةً إلى استمرارية في عدم تجانس الانقباض البطيء/السريع، المستقل عن نوع الألياف، عبر مختلف الألياف العضلية.
ومن المثير للاهتمام، أن الجينات المحركة في المكون الرئيسي الثاني (PC2) أظهرت ارتباطًا جيدًا بين النسخ والبروتينات (r = 0.663) (الشكل 2G)، مما يشير إلى أن أنواع ألياف العضلات البطيئة والسريعة الانقباض، وخاصةً الخصائص الانقباضية والأيضية لألياف العضلات الهيكلية، تخضع لتنظيم النسخ. مع ذلك، لم تُظهر الجينات المحركة في المكون الرئيسي الأول (PC1) أي ارتباط بين النسخ والبروتينات (r = -0.027) (الشكل 2H)، مما يشير إلى أن الاختلافات غير المرتبطة بأنواع ألياف العضلات البطيئة/السريعة الانقباض تخضع في الغالب لتنظيم ما بعد النسخ. ولأن الاختلافات في المكون الرئيسي الأول (PC1) فُسِّرت في المقام الأول بمصطلحات علم وظائف الجينات الريبوسومية، ونظرًا لأن الريبوسومات تلعب دورًا حاسمًا ومتخصصًا في الخلية من خلال المشاركة الفعالة في ترجمة البروتين والتأثير عليها،³¹ فقد شرعنا بعد ذلك في دراسة هذا التباين الريبوسومي غير المتوقع.
قمنا أولاً بتلوين مخطط تحليل المكونات الرئيسية للبروتينات وفقًا للوفرة النسبية للبروتينات في مصطلح GOCC "الريبوسوم السيتوبلازمي" (الشكل 3أ). على الرغم من أن هذا المصطلح مُركّز على الجانب الموجب من PC1، مما ينتج عنه تدرج صغير، إلا أن البروتينات الريبوسومية تُحرك التوزيع في كلا اتجاهي PC1 (الشكل 3أ). شملت البروتينات الريبوسومية المُركّزة على الجانب السالب من PC1 كلاً من RPL18 وRPS18 وRPS13 (الشكل 3ب)، بينما كانت RPL31 وRPL35 وRPL38 (الشكل 3ج) هي المحركات الرئيسية على الجانب الموجب من PC1. ومن المثير للاهتمام، أن RPL38 وRPS13 كانا مُعبرين بشكل كبير في العضلات الهيكلية مقارنةً بالأنسجة الأخرى (الشكل التكميلي 7أ). لم تُلاحظ هذه البصمات الريبوسومية المميزة في PC1 في النسخ الجيني (الشكل التكميلي 7ب)، مما يشير إلى تنظيم ما بعد النسخ.
أ. مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) مُلوّن وفقًا لمصطلحات علم وظائف الجينات (GO) للريبوسومات السيتوبلازمية عبر البروتينوم. تشير الأسهم إلى اتجاه التباين الناتج عن البروتين في مخطط PCA. يتوافق طول الخط مع درجة المكون الرئيسي لبروتين معين. ب، ج. مخططات خصائص PCA لـ RPS13 وRPL38. د. تحليل التجميع الهرمي غير الخاضع للإشراف لبروتينات الريبوسومات السيتوبلازمية. هـ. نموذج هيكلي للريبوسوم 80S (PDB: 4V6X) يُبرز بروتينات الريبوسومات ذات الوفرة المختلفة في ألياف العضلات الهيكلية. و. بروتينات الريبوسومات ذات القياس المتكافئ المختلفة المتمركزة بالقرب من قناة خروج mRNA.
سبق أن طُرحت مفاهيم عدم تجانس الريبوسومات وتخصصها، حيث يمكن لوجود مجموعات فرعية متميزة من الريبوسومات (عدم تجانس الريبوسومات) أن يؤثر بشكل مباشر على ترجمة البروتين في مختلف الأنسجة³² والخلايا³³ من خلال الترجمة الانتقائية لمجموعات محددة من نسخ mRNA³⁴ (تخصص الريبوسومات). ولتحديد المجموعات الفرعية من بروتينات الريبوسومات المتشاركة في التعبير في ألياف العضلات الهيكلية، أجرينا تحليلًا للتجميع الهرمي غير الخاضع للإشراف لبروتينات الريبوسومات في البروتينوم (الشكل 3D، مجموعة البيانات التكميلية 8). وكما هو متوقع، لم تتجمع بروتينات الريبوسومات حسب نوع الألياف بناءً على MYH. ومع ذلك، حددنا ثلاث مجموعات متميزة من بروتينات الريبوسومات؛ المجموعة الأولى (ribosomal_cluster_1) مُنظمة بشكل مشترك مع RPL³⁸، وبالتالي يزداد تعبيرها في الألياف ذات النمط الموجب للمكون الرئيسي الأول (PC1). تُنظَّم المجموعة الثانية (ribosomal_cluster_2) بالتزامن مع RPS13، وترتفع مستوياتها في الألياف ذات النمط الظاهري السلبي للمكون الرئيسي الأول (PC1). أما المجموعة الثالثة (ribosomal_cluster_3) فلا تُظهر تعبيرًا تفاضليًا منسقًا في ألياف العضلات الهيكلية، ويمكن اعتبارها البروتين الريبوسومي "الأساسي" في العضلات الهيكلية. تحتوي كلتا المجموعتين الريبوسوميتين 1 و2 على بروتينات ريبوسومية سبق أن ثبت أنها تُنظِّم الترجمة البديلة (مثل RPL10A وRPL38 وRPS19 وRPS25) وتؤثر وظيفيًا على النمو (مثل RPL10A وRPL38).^{34،35،36،37،38} وتماشيًا مع نتائج تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، أظهر التمثيل غير المتجانس لهذه البروتينات الريبوسومية عبر الألياف استمراريةً أيضًا (الشكل التكميلي 7C).
لتصوير مواقع البروتينات الريبوزومية غير المتجانسة داخل الريبوزوم، استخدمنا نموذجًا بنيويًا للريبوزوم البشري 80S (بنك بيانات البروتين: 4V6X) (الشكل 3E). بعد عزل البروتينات الريبوزومية التابعة لمجموعات ريبوزومية مختلفة، لم تكن مواقعها متطابقة تمامًا، مما يشير إلى أن منهجنا لم يُحقق إثراءً لبعض مناطق/أجزاء الريبوزوم. مع ذلك، ومن المثير للاهتمام، أن نسبة بروتينات الوحدة الفرعية الكبيرة في المجموعة 2 كانت أقل منها في المجموعتين 1 و3 (الشكل التكميلي 7D). لاحظنا أن البروتينات ذات القياس المتكافئ المتغير في ألياف العضلات الهيكلية كانت متمركزة بشكل أساسي على سطح الريبوزوم (الشكل 3E)، وهو ما يتوافق مع قدرتها على التفاعل مع عناصر موقع دخول الريبوزوم الداخلي (IRES) في مجموعات mRNA المختلفة، وبالتالي تنسيق الترجمة الانتقائية. 40، 41 علاوة على ذلك، وُجدت العديد من البروتينات ذات النسب الكمية المتغيرة في ألياف العضلات الهيكلية بالقرب من مناطق وظيفية مثل نفق خروج الحمض النووي الريبوزي الرسول (الشكل 3F)، والتي تنظم بشكل انتقائي استطالة الترجمة وتوقف ببتيدات محددة. 42 باختصار، تشير بياناتنا إلى أن النسب الكمية لبروتينات الريبوسوم في العضلات الهيكلية تُظهر تباينًا، مما يؤدي إلى اختلافات بين ألياف العضلات الهيكلية.
بعد ذلك، شرعنا في تحديد بصمات الألياف العضلية سريعة الانقباض وبطيئة الانقباض، واستكشاف آليات تنظيمها الجيني. وبمقارنة مجموعات الألياف سريعة الانقباض وبطيئة الانقباض التي حددها برنامج UMAP في مجموعتي البيانات (الشكلان 1G-H و4A-B)، كشفت تحليلات النسخ والبروتينات عن 1366 و804 سمة مختلفة الوفرة، على التوالي (الشكلان 4A-B، ومجموعات البيانات التكميلية 9-12). لاحظنا الاختلافات المتوقعة في البصمات المتعلقة بالقطع العضلية (مثل التروبوميوسين والتروبونين)، واقتران الإثارة والانقباض (أشكال SERCA)، واستقلاب الطاقة (مثل ALDOA وCKB). علاوة على ذلك، تم التعبير بشكل مختلف عن النسخ والبروتينات التي تنظم إضافة اليوبيكويتين إلى البروتينات في الألياف سريعة الانقباض وبطيئة الانقباض (مثل USP54 وSH3RF2 وUSP28 وUSP48) (الشكلان 4A-B). علاوة على ذلك، لوحظ ارتفاع ملحوظ في التعبير الجيني للبروتين الميكروبي RP11-451G4.2 (DWORF)، الذي سبق أن ثبت اختلاف تعبيره بين أنواع ألياف عضلات الحملان⁴³، والذي يعزز نشاط SERCA في عضلة القلب⁴⁴، في ألياف العضلات الهيكلية البطيئة (الشكل 4أ). وبالمثل، على مستوى الألياف الفردية، لوحظت اختلافات كبيرة في المؤشرات المعروفة، مثل نظائر نازعة هيدروجين اللاكتات المرتبطة بالتمثيل الغذائي (LDHA وLDHB، الشكل 4ج والشكل التكميلي 8أ)^45،46، بالإضافة إلى مؤشرات خاصة بنوع الألياف لم تكن معروفة سابقًا (مثل IRX3 وUSP54 وUSP28 وDPYSL3) (الشكل 4ج). كان هناك تداخل كبير في السمات المُعبر عنها بشكل مختلف بين مجموعتي بيانات النسخ والبروتينات (الشكل التكميلي 8ب)، بالإضافة إلى ارتباط في التغير النسبي مدفوع بشكل رئيسي بالتعبير التفاضلي الأكثر وضوحًا لسمات الساركومير (الشكل التكميلي 8ج). والجدير بالذكر أن بعض التوقيعات (مثل USP28 و USP48 و GOLGA4 و AKAP13) أظهرت تنظيمًا قويًا بعد النسخ فقط على مستوى البروتينات وكان لها أنماط تعبير خاصة بنوع ألياف الانقباض البطيء/السريع (الشكل التكميلي 8C).
مخططات البركان A وB تُقارن بين المجموعات البطيئة والسريعة المُحددة بواسطة مخططات تقريب وإسقاط التشعب الموحد (UMAP) في الأشكال 1G-H. تُمثل النقاط الملونة النسخ أو البروتينات التي تختلف اختلافًا معنويًا عند FDR < 0.05، بينما تُمثل النقاط الداكنة النسخ أو البروتينات التي تختلف اختلافًا معنويًا عند تغيير لوغاريتمي > 1. أُجري تحليل إحصائي ثنائي الاتجاه باستخدام اختبار DESeq2 Wald مع قيم p المُعدلة وفقًا لـ Benjamini-Hochberg (علم النسخ) أو طريقة نموذج Limma الخطي مع التحليل البايزي التجريبي متبوعًا بتعديل Benjamini-Hochberg للمقارنات المتعددة (علم البروتينات). C مخططات التوقيع للجينات أو البروتينات المُعبر عنها بشكل تفاضلي بين الألياف البطيئة والسريعة. D تحليل إثراء النسخ والبروتينات المُعبر عنها بشكل تفاضلي معنوي. القيم المتداخلة مُثرية في كلتا مجموعتي البيانات، وقيم النسخ مُثرية فقط في مجموعة النسخ، وقيم البروتينات مُثرية فقط في مجموعة البروتينات. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام حزمة clusterProfiler مع قيم p المعدلة وفقًا لطريقة بنجاميني-هوخبيرغ. هـ. عوامل النسخ الخاصة بنوع الألياف التي تم تحديدها بواسطة SCENIC بناءً على درجات خصوصية المنظم المستمدة من SCENIC والتعبير التفاضلي للـ mRNA بين أنواع الألياف. و. تحديد خصائص عوامل النسخ المختارة التي تُظهر تعبيرًا تفاضليًا بين الألياف البطيئة والسريعة.
ثم أجرينا تحليلًا للتمثيل الزائد للجينات والبروتينات المُمثلة بشكل مختلف (الشكل 4D، مجموعة البيانات التكميلية 13). وكشف إثراء المسارات للسمات التي اختلفت بين مجموعتي البيانات عن اختلافات متوقعة، مثل أكسدة بيتا للأحماض الدهنية وعمليات استقلاب الكيتونات (الألياف البطيئة)، وانقباض الخيوط العضلية/العضلات (الألياف السريعة والبطيئة، على التوالي)، وعمليات هدم الكربوهيدرات (الألياف السريعة). كما ارتفع نشاط فوسفاتاز البروتين سيرين/ثريونين في الألياف السريعة، مدفوعًا بسمات مثل الوحدات الفرعية التنظيمية والتحفيزية للفوسفاتاز (PPP3CB وPPP1R3D وPPP1R3A)، والتي من المعروف أنها تنظم استقلاب الجليكوجين (47) (الأشكال التكميلية 8D-E). تضمنت المسارات الأخرى الغنية بالألياف السريعة أجسام المعالجة (P-) (YTHDF3، TRIM21، LSM2) في البروتينوم (الشكل التكميلي 8F)، والتي يُحتمل أن تكون متورطة في التنظيم ما بعد النسخ (48)، ونشاط عامل النسخ (SREBF1، RXRG، RORA) في النسخوم (الشكل التكميلي 8G). أما الألياف البطيئة فقد كانت غنية بنشاط الأكسدة والاختزال (BDH1، DCXR، TXN2) (الشكل التكميلي 8H)، وربط الأميد (CPTP، PFDN2، CRYAB) (الشكل التكميلي 8I)، والمادة الخلوية خارج الخلية (CTSD، ADAMTSL4، LAMC1) (الشكل التكميلي 8J)، ونشاط مستقبلات الربيطة (FNDC5، SPX، NENF) (الشكل التكميلي 8K).
للحصول على فهم أعمق للتنظيم النسخي الكامن وراء خصائص أنواع ألياف العضلات البطيئة/السريعة، أجرينا تحليلًا لإثراء عوامل النسخ باستخدام SCENIC49 (مجموعة البيانات التكميلية 14). وقد لوحظ إثراء معنوي للعديد من عوامل النسخ بين ألياف العضلات السريعة والبطيئة (الشكل 4هـ). وشمل ذلك عوامل نسخ مثل MAFA، الذي سبق ربطه بتطور ألياف العضلات السريعة،⁵⁰ بالإضافة إلى العديد من عوامل النسخ التي لم يسبق ربطها ببرامج جينية خاصة بنوع ألياف العضلات. ومن بين هذه العوامل، كانت PITX1 وEGR1 وMYF6 هي عوامل النسخ الأكثر إثراءً في ألياف العضلات السريعة (الشكل 4هـ). في المقابل، كان ZSCAN30 وEPAS1 (المعروف أيضًا باسم HIF2A) هما عاملي النسخ الأكثر إثراءً في ألياف العضلات البطيئة (الشكل 4هـ). وتماشيًا مع ذلك، تم التعبير عن MAFA بمستويات أعلى في منطقة UMAP المقابلة لألياف العضلات السريعة، بينما أظهر EPAS1 نمط تعبير معاكسًا (الشكل 4و).
إضافةً إلى الجينات المعروفة المُشفِّرة للبروتينات، توجد أنماط حيوية عديدة من الحمض النووي الريبوزي غير المُشفِّر (RNA) التي قد تُشارك في تنظيم نمو الإنسان وأمراضه.^{51، 52} في مجموعات بيانات النسخ الجيني، تُظهر العديد من أنواع الحمض النووي الريبوزي غير المُشفِّر (RNA) خصوصيةً لنوع الألياف (الشكل 5أ ومجموعة البيانات التكميلية 15)، بما في ذلك LINC01405، الذي يتميز بخصوصية عالية للألياف البطيئة، وقد أُفيد بانخفاضه في عضلات مرضى اعتلال العضلات الميتوكوندري.⁵³ في المقابل، يُظهر RP11-255P5.3، المُطابق لجين lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)⁵⁴، خصوصيةً لنوع الألياف السريعة. يُظهر كلٌّ من LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) وRP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) خصوصيةً في العضلات الهيكلية (الشكلان التكميليان 9أ-ب)، ولا توجد جينات انقباضية معروفة ضمن نطاقهما الجينومي البالغ 1 ميجابايت، مما يشير إلى أنهما يلعبان دورًا متخصصًا في تنظيم أنواع الألياف بدلًا من تنظيم الجينات الانقباضية المجاورة. وقد تم تأكيد أنماط التعبير الجيني الخاصة بنوع الألياف البطيئة/السريعة لكلٍّ من LINC01405 وRP11-255P5.3، على التوالي، باستخدام تقنية RNAscope (الشكلان 5ب-ج).
أ. تخضع نسخ الحمض النووي الريبوزي غير المشفر لتنظيم دقيق في ألياف العضلات البطيئة والسريعة الانقباض. ب. صور نموذجية من تقنية RNAscope تُظهر خصوصية نوع ألياف العضلات البطيئة والسريعة الانقباض لكل من LINC01405 وRP11-255P5.3 على التوالي. مقياس الرسم = 50 ميكرومتر. ج. قياس التعبير الجيني للحمض النووي الريبوزي غير المشفر الخاص بنوع ألياف العضلات باستخدام تقنية RNAscope (عدد العينات = 3 خزعات من أفراد مستقلين، مع مقارنة ألياف العضلات السريعة والبطيئة داخل كل فرد). أُجري التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الطرف. تُظهر المخططات الصندوقية الوسيط والربيعين الأول والثالث، مع خطوط تشير إلى القيم الدنيا والقصوى. د. سير عمل تحديد البروتينات الميكروبية من الصفر (تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com). هـ. يُعبَّر عن البروتين الميكروبي LINC01405_ORF408:17441:17358 تحديدًا في ألياف العضلات الهيكلية البطيئة (عدد العينات = 5 خزعات من مشاركين مستقلين، مع مقارنة ألياف العضلات السريعة والبطيئة لدى كل مشارك). أُجري التحليل الإحصائي باستخدام نموذج ليم الخطي مع منهج بايزي تجريبي، متبوعًا بطريقة بنجاميني-هوخبيرغ للمقارنات المتعددة مع تعديل قيمة p. تُظهر المخططات الصندوقية الوسيط والربيعين الأول والثالث، مع خطوط تشير إلى القيم القصوى/الدنيا.
أظهرت دراسات حديثة أن العديد من النسخ غير المشفرة المفترضة تُشفّر بروتينات ميكروبية مُستنسخة، بعضها يُنظّم وظائف العضلات.^{44، 55} ولتحديد البروتينات الميكروبية ذات الخصوصية المحتملة لأنواع الألياف، بحثنا في مجموعة بيانات البروتينات الخاصة بنا التي تضم 1000 ليف عضلي باستخدام ملف FASTA مُخصّص يحتوي على تسلسلات النسخ غير المشفرة (عددها 305) الموجودة في مجموعة بيانات النسخ الخاصة بـ 1000 ليف عضلي (الشكل 5D). حددنا 197 بروتينًا ميكروبيًا من 22 نسخة مختلفة، 71 منها مُنظّمة بشكل مختلف بين ألياف العضلات الهيكلية البطيئة والسريعة (الشكل التكميلي 9C ومجموعة البيانات التكميلية 16). بالنسبة لـ LINC01405، تم تحديد ثلاثة منتجات بروتينية ميكروبية، أظهر أحدها خصوصية مماثلة للألياف البطيئة لنسخته (الشكل 5E والشكل التكميلي 9D). وبذلك، حددنا LINC01405 كجين يُشفّر بروتينًا ميكروبيًا خاصًا بألياف العضلات الهيكلية البطيئة.
لقد طورنا منهجية عمل شاملة لتوصيف البروتينات على نطاق واسع في ألياف العضلات الفردية، وحددنا عوامل تنظيم عدم تجانس الألياف في الحالات الصحية. طبقنا هذه المنهجية لفهم كيفية تأثير اعتلالات العضلات الخيطية على عدم تجانس ألياف العضلات الهيكلية. اعتلالات العضلات الخيطية هي أمراض عضلية وراثية تُسبب ضعفًا عضليًا، وتظهر لدى الأطفال المصابين بمجموعة من المضاعفات، بما في ذلك ضيق التنفس، والجنف، ومحدودية حركة الأطراف.^19،20 عادةً، في اعتلالات العضلات الخيطية، تؤدي الطفرات المسببة للأمراض في جينات مثل أكتين ألفا 1 (ACTA1) إلى غلبة ألياف العضلات البطيئة الانقباض، على الرغم من أن هذا التأثير غير متجانس. ومن الاستثناءات البارزة اعتلال العضلات الخيطي الناتج عن تروبونين T1 (TNNT1)، والذي يتميز بغلبة الألياف السريعة. وبالتالي، فإن الفهم الأفضل لعدم التجانس الكامن وراء خلل تنظيم ألياف العضلات الهيكلية الذي لوحظ في اعتلالات العضلات الخيطية قد يساعد في كشف العلاقة المعقدة بين هذه الأمراض ونوع ألياف العضلات.
بالمقارنة مع عينات التحكم السليمة (ن=3 لكل مجموعة)، أظهرت الألياف العضلية المعزولة من مرضى اعتلال العضلات الخيطي المصابين بطفرات في جيني ACTA1 وTNNT1 ضمورًا أو خللًا ملحوظًا في حجم الألياف العضلية (الشكل 6أ، الجدول التكميلي 3). وقد شكّل هذا تحديات تقنية كبيرة لتحليل البروتينات نظرًا لمحدودية كمية العينة المتاحة. مع ذلك، تمكّنا من الكشف عن 2485 بروتينًا في 272 ليفًا عضليًا هيكليًا. بعد ترشيح 1000 بروتين على الأقل لكل ليف، خضعت 250 ليفًا لتحليل المعلوماتية الحيوية. بعد الترشيح، تم قياس متوسط ​​1573 ± 359 بروتينًا لكل ليف (الشكل التكميلي 10أ، مجموعات البيانات التكميلية 17-18). والجدير بالذكر أنه على الرغم من الانخفاض الكبير في حجم الألياف، إلا أن عمق البروتينات في عينات مرضى اعتلال العضلات الخيطي لم ينخفض ​​إلا بشكل طفيف. علاوة على ذلك، سمحت لنا معالجة هذه البيانات باستخدام ملفات FASTA الخاصة بنا (بما في ذلك النسخ غير المشفرة) بتحديد خمسة بروتينات ميكروبية في ألياف العضلات الهيكلية لدى مرضى اعتلال العضلات النيماليني (مجموعة البيانات التكميلية 19). وكان النطاق الديناميكي للبروتينات أوسع بكثير، وتوافقت البروتينات الكلية في المجموعة الضابطة بشكل جيد مع نتائج تحليل بروتينات سابق لـ 1000 ليف (الشكل التكميلي 10 ب - ج).
أ. صور مجهرية تُظهر ضمور أو خلل الألياف، وغلبة أنواع الألياف المختلفة بناءً على جين MYH في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1. مقياس الرسم = 100 ميكرومتر. لضمان قابلية تكرار التلوين لدى مرضى ACTA1 وTNNT1، تم تلوين ثلاث خزعات من المرضى مرتين إلى ثلاث مرات (أربعة مقاطع لكل حالة) قبل اختيار الصور التمثيلية. ب. نسب أنواع الألياف لدى المشاركين بناءً على جين MYH. ج. مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لألياف العضلات الهيكلية لدى مرضى اعتلالات العضلات الخيطية والمجموعات الضابطة. د. ألياف العضلات الهيكلية من مرضى اعتلالات العضلات الخيطية ومجموعات الضبط، مُسقطة على مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) المُستخلص من 1000 ليف تم تحليلها في الشكل 2. على سبيل المثال، مخططات فولكانو تُقارن الاختلافات بين المشاركين المصابين باعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1 ومجموعات الضبط، وبين المشاركين المصابين باعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1. تُشير الدوائر الملونة إلى البروتينات التي كانت مختلفة بشكلٍ دال إحصائيًا عند π < 0.05، بينما تُشير النقاط الداكنة إلى البروتينات التي كانت مختلفة بشكلٍ دال إحصائيًا عند FDR < 0.05. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام طريقة نموذج ليما الخطي وطرق بايز التجريبية، متبوعةً بتعديل قيمة p للمقارنات المتعددة باستخدام طريقة بنجاميني-هوخبيرغ. ح. تحليل إثراء البروتينات المُعبر عنها بشكلٍ تفاضلي دال إحصائيًا عبر البروتينوم بأكمله وفي ألياف النوع 1 و2A. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام حزمة clusterProfiler وقيم p المُعدلة وفقًا لطريقة بنجاميني-هوخبيرغ. أنا، ج. مخططات تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ملونة حسب مصطلحات المصفوفة خارج الخلية وعلم الجينات الميتوكوندرية (GO).
نظرًا لأن اعتلالات العضلات الخيطية قد تؤثر على نسبة أنواع الألياف العضلية المُعبرة عن جين MYH في العضلات الهيكلية،^19،20 فقد فحصنا أولًا أنواع الألياف العضلية المُعبرة عن جين MYH لدى مرضى اعتلالات العضلات الخيطية ومجموعة الضبط. حددنا نوع الألياف العضلية باستخدام طريقة غير متحيزة سبق وصفها لاختبار 1000 ليف عضلي (الشكلان التكميليان 10D-E)، ولم نتمكن مجددًا من تحديد ألياف عضلية نقية من النوع 2X (الشكل 6B). لاحظنا تأثيرًا غير متجانس لاعتلالات العضلات الخيطية على نوع الألياف العضلية، حيث كان لدى مريضين مصابين بطفرات في جين ACTA1 نسبة متزايدة من الألياف العضلية من النوع 1، بينما كان لدى مريضين مصابين باعتلال العضلات الخيطية من النوع TNNT1 نسبة منخفضة من الألياف العضلية من النوع 1 (الشكل 6B). في الواقع، انخفض التعبير عن جين MYH2 ونظائر التروبونين السريع (TNNC2 وTNNI2 وTNNT3) في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1، بينما انخفض التعبير عن جين MYH7 في اعتلالات العضلات الخيطية TNNT1 (الشكل التكميلي 11أ). يتوافق هذا مع التقارير السابقة عن تحوّل غير متجانس في أنواع الألياف العضلية في اعتلالات العضلات الخيطية.^19،20 وقد أكدنا هذه النتائج باستخدام الكيمياء المناعية النسيجية، ووجدنا أن المرضى المصابين باعتلال العضلات الخيطية ACTA1 لديهم غلبة للألياف العضلية من النوع 1، بينما كان النمط معاكساً لدى المرضى المصابين باعتلال العضلات الخيطية TNNT1 (الشكل 6أ).
على مستوى البروتينات في الألياف العضلية المفردة، تجمعت ألياف العضلات الهيكلية من مرضى اعتلال العضلات النيماليني ACTA1 وTNNT1 مع غالبية ألياف المجموعة الضابطة، وكانت ألياف اعتلال العضلات النيماليني TNNT1 هي الأكثر تضررًا بشكل عام (الشكل 6C). وقد تجلى ذلك بوضوح عند رسم مخططات تحليل المكونات الرئيسية (PCA) للألياف شبه المنتفخة لكل مريض، حيث بدا مريضا اعتلال العضلات النيماليني TNNT1 رقم 2 و3 الأبعد عن عينات المجموعة الضابطة (الشكل التكميلي 11B، مجموعة البيانات التكميلية 20). لفهم أفضل لكيفية مقارنة ألياف مرضى اعتلال العضلات بالألياف السليمة، استخدمنا معلومات تفصيلية مستقاة من تحليل البروتينات لـ 1000 ليف عضلي من مشاركين بالغين أصحاء. قمنا بإسقاط الألياف من مجموعة بيانات اعتلال العضلات (مرضى اعتلال العضلات النيماليني ACTA1 وTNNT1 والمجموعة الضابطة) على مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) المستخلص من تحليل البروتينات لـ 1000 ليف عضلي (الشكل 6D). كان توزيع أنواع ألياف MYH على طول المحور PC2 في الألياف الضابطة مشابهًا لتوزيع الألياف المُستخلص من تحليل البروتينات لـ 1000 ليف. مع ذلك، انزاحت معظم الألياف لدى مرضى اعتلال العضلات الخيطي نحو أسفل المحور PC2، متداخلةً مع ألياف العضلات سريعة الانقباض السليمة، بغض النظر عن نوع ألياف MYH الأصلي. وبالتالي، على الرغم من أن مرضى اعتلال العضلات الخيطي ACTA1 أظهروا انزياحًا نحو ألياف النوع 1 عند قياسها باستخدام طرق تعتمد على MYH، إلا أن كلاً من اعتلال العضلات الخيطي ACTA1 واعتلال العضلات الخيطي TNNT1 أدى إلى انزياح بروتينات ألياف العضلات الهيكلية نحو ألياف سريعة الانقباض.
ثم قارنّا كل مجموعة من المرضى مباشرةً مع مجموعات الضبط السليمة، وحددنا 256 و552 بروتينًا مختلفًا في التعبير في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1 على التوالي (الشكل 6E-G والشكل التكميلي 11C، مجموعة البيانات التكميلية 21). وكشف تحليل إثراء الجينات عن انخفاض متناسق في بروتينات الميتوكوندريا (الشكل 6H-I، مجموعة البيانات التكميلية 22). والمثير للدهشة، أنه على الرغم من اختلاف أنواع الألياف السائدة في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1، كان هذا الانخفاض مستقلًا تمامًا عن نوع الألياف القائم على MYH (الشكل 6H والأشكال التكميلية 11D-I، مجموعة البيانات التكميلية 23). كما لوحظ تنظيم ثلاثة بروتينات ميكروبية في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 أو TNNT1. أظهر اثنان من هذه البروتينات الدقيقة، وهما ENSG00000215483_TR14_ORF67 (المعروف أيضًا باسم LINC00598 أو Lnc-FOXO1) وENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2)، وفرةً متفاوتةً فقط في ألياف العضلات من النوع الأول. وقد ذُكر سابقًا أن ENSG00000215483_TR14_ORF67 يلعب دورًا في تنظيم دورة الخلية.⁵⁶ من ناحية أخرى، ازداد مستوى ENSG00000232046_TR1_ORF437 (الموافق لـ LINC01798) في كلٍ من ألياف العضلات من النوع الأول والنوع 2A في اعتلال العضلات الخيطي ACTA1 مقارنةً بالأفراد الأصحاء (الشكل التكميلي 12A، مجموعة البيانات التكميلية 24). في المقابل، لم تتأثر البروتينات الريبوزومية إلى حد كبير باعتلال العضلات الخيطي، على الرغم من انخفاض تنظيم RPS17 في اعتلال العضلات الخيطي ACTA1 (الشكل 6E).
كشف تحليل الإثراء أيضًا عن زيادة في عمليات الجهاز المناعي في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1، بينما ازداد التصاق الخلايا أيضًا في اعتلال العضلات الخيطية TNNT1 (الشكل 6H). وانعكس إثراء هذه العوامل خارج الخلوية في تحول بروتينات المصفوفة خارج الخلوية في تحليل المكونات الرئيسية (PCA) في الموضعين PC1 وPC2 باتجاه سلبي (أي نحو الألياف الأكثر تضررًا) (الشكل 6J). وأظهرت كلتا مجموعتي المرضى زيادة في التعبير عن البروتينات خارج الخلوية المشاركة في الاستجابات المناعية وآليات إصلاح غشاء الليف العضلي، مثل الأنكسينات (ANXA1، ANXA2، ANXA5)^57،58 وبروتينها المتفاعل S100A1¹⁵⁹ (الأشكال التكميلية 12B-C). وقد أُبلغ سابقًا عن تعزيز هذه العملية في ضمور العضلات⁶⁰، ولكن، على حد علمنا، لم يسبق ربطها باعتلالات العضلات الخيطية. يُعدّ الأداء الطبيعي لهذه الآلية الجزيئية ضروريًا لإصلاح غشاء الليف العضلي بعد الإصابة، ولاندماج الخلايا العضلية المتكونة حديثًا مع الألياف العضلية 58،61. وبالتالي، فإن زيادة نشاط هذه العملية في كلتا مجموعتي المرضى يشير إلى استجابة ترميمية للإصابة الناجمة عن عدم استقرار الألياف العضلية.
كانت تأثيرات كل اعتلال عضلي نيماليني مترابطة بشكل جيد (r = 0.736) وأظهرت تداخلاً معقولاً (الشكلان التكميليان 11A و11B)، مما يشير إلى أن اعتلالي ACTA1 وTNNT1 العضليين النيماليين لهما تأثيرات متشابهة على البروتينات. مع ذلك، تم تنظيم بعض البروتينات فقط في اعتلال ACTA1 أو TNNT1 العضلي النيماليني (الشكلان التكميليان 11A و11C). كان البروتين المحفز للتليف MFAP4 من بين أكثر البروتينات ارتفاعًا في اعتلال TNNT1 العضلي النيماليني، لكنه ظل دون تغيير في اعتلال ACTA1 العضلي النيماليني. أما SKIC8، وهو أحد مكونات مركب PAF1C المسؤول عن تنظيم نسخ جينات HOX، فقد انخفض مستواه في اعتلال TNNT1 العضلي النيماليني، لكنه لم يتأثر في اعتلال ACTA1 العضلي النيماليني (الشكل التكميلي 11A). أظهرت المقارنة المباشرة بين اعتلال العضلات الخيطي الناتج عن طفرة ACTA1 واعتلال العضلات الخيطي الناتج عن طفرة TNNT1 انخفاضًا أكبر في بروتينات الميتوكوندريا وزيادة في بروتينات الجهاز المناعي في اعتلال العضلات الخيطي الناتج عن طفرة TNNT1 (الشكل 6G-H والأشكال التكميلية 11C و11H-I). تتوافق هذه البيانات مع الضمور/الخلل العضلي الأكبر الملاحظ في اعتلال العضلات الخيطي الناتج عن طفرة TNNT1 مقارنةً باعتلال العضلات الخيطي الناتج عن طفرة TNNT1 (الشكل 6A)، مما يشير إلى أن اعتلال العضلات الخيطي الناتج عن طفرة TNNT1 يمثل شكلاً أكثر حدة من المرض.
لتقييم ما إذا كانت التأثيرات الملحوظة لاعتلال العضلات النيماليني تستمر على مستوى العضلة بأكملها، أجرينا تحليلًا بروتيوميًا شاملًا لعينات خزعة عضلية من نفس مجموعة مرضى اعتلال العضلات النيماليني TNNT1، وقارناها بعينات ضابطة (ن = 3 لكل مجموعة) (الشكل التكميلي 13أ، مجموعة البيانات التكميلية 25). وكما هو متوقع، كانت العينات الضابطة متقاربة في تحليل المكونات الرئيسية، بينما أظهر مرضى اعتلال العضلات النيماليني TNNT1 تباينًا أكبر بين العينات، مشابهًا لما لوحظ في تحليل الألياف المفردة (الشكل التكميلي 13ب). أعاد التحليل الشامل إنتاج البروتينات المُعبَّر عنها بشكل مختلف (الشكل التكميلي 13ج، مجموعة البيانات التكميلية 26) والعمليات البيولوجية (الشكل التكميلي 13د، مجموعة البيانات التكميلية 27) التي تم تسليط الضوء عليها من خلال مقارنة الألياف الفردية، ولكنه فقد القدرة على التمييز بين أنواع الألياف المختلفة، وفشل في تفسير التأثيرات المرضية غير المتجانسة عبر الألياف.
تُظهر هذه البيانات مجتمعةً أن تحليل البروتينات على مستوى الألياف العضلية المفردة يُمكن أن يُسلط الضوء على السمات البيولوجية السريرية التي لا يُمكن الكشف عنها باستخدام طرق مُحددة مثل التحليل المناعي الغربي. علاوةً على ذلك، تُبرز هذه البيانات قصور استخدام تصنيف ألياف الأكتين (MYH) وحده لوصف التكيف الظاهري. في الواقع، على الرغم من اختلاف تبديل نوع الألياف بين اعتلالات العضلات الخيطية للأكتين والتروبونين، فإن كلا النوعين من اعتلالات العضلات الخيطية يفصل تصنيف ألياف MYH عن استقلاب ألياف العضلات الهيكلية، مما يُؤدي إلى بروتينات عضلية أسرع وأقل تأكسدًا.
يُعدّ التباين الخلوي أمرًا بالغ الأهمية للأنسجة لتلبية احتياجاتها المتنوعة. في العضلات الهيكلية، يُوصف هذا التباين غالبًا بأنواع الألياف التي تتميز بدرجات متفاوتة من إنتاج القوة وقابلية الإجهاد. مع ذلك، من الواضح أن هذا لا يُفسر سوى جزء صغير من تباين ألياف العضلات الهيكلية، الذي يتسم بتنوع وتعقيد وتعدد جوانب أكبر بكثير مما كان يُعتقد سابقًا. وقد ساهمت التطورات التكنولوجية في تسليط الضوء على العوامل المنظمة لألياف العضلات الهيكلية. في الواقع، تشير بياناتنا إلى أن ألياف النوع 2X قد لا تُمثل نوعًا فرعيًا متميزًا من ألياف العضلات الهيكلية. علاوة على ذلك، حددنا البروتينات الأيضية والبروتينات الريبوزومية والبروتينات المرتبطة بالخلايا كعوامل رئيسية في تحديد تباين ألياف العضلات الهيكلية. ومن خلال تطبيق منهجية البروتينات الخاصة بنا على عينات من مرضى مصابين باعتلال عضلي ناتج عن الديدان الأسطوانية، أثبتنا كذلك أن تصنيف الألياف القائم على جين MYH لا يعكس بشكل كامل تباين العضلات الهيكلية، خاصةً عند حدوث اضطراب في النظام. في الواقع، بغض النظر عن نوع الألياف القائمة على MYH، فإن اعتلال العضلات الناتج عن الديدان الأسطوانية يؤدي إلى تحول نحو ألياف أسرع وأقل تأكسدًا.
صُنفت ألياف العضلات الهيكلية منذ القرن التاسع عشر. وقد أتاحت لنا تحليلات علم الجينوم الحديثة البدء في فهم أنماط التعبير الجيني لأنواع ألياف MYH المختلفة واستجاباتها للمحفزات المتنوعة. وكما هو موضح هنا، تتميز مناهج علم الجينوم بحساسية أعلى في تحديد كمية مؤشرات نوع الألياف مقارنةً بالطرق التقليدية القائمة على الأجسام المضادة، دون الاعتماد على قياس مؤشر واحد (أو عدد قليل من المؤشرات) لتحديد نوع ألياف العضلات الهيكلية. استخدمنا مسارات عمل تكميلية لعلم النسخ وعلم البروتينات، ودمجنا النتائج لدراسة التنظيم النسخي وما بعد النسخي لتغاير الألياف في ألياف العضلات الهيكلية البشرية. أسفرت هذه المسارات عن عدم القدرة على تحديد ألياف من النوع 2X النقي على مستوى البروتين في العضلة المتسعة الوحشية لدى مجموعتنا من الشباب الأصحاء. يتوافق هذا مع دراسات سابقة أجريت على ألياف مفردة، والتي وجدت أقل من 1% من ألياف 2X النقية في العضلة المتسعة الوحشية السليمة، مع ضرورة تأكيد هذه النتائج في عضلات أخرى مستقبلاً. إن التناقض بين الكشف عن ألياف 2X نقية تقريبًا على مستوى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) ووجود ألياف 2A/2X مختلطة فقط على مستوى البروتين أمرٌ محير. لا يخضع التعبير الجيني لنظائر MYH لإيقاع الساعة البيولوجية،⁶⁷ مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن نكون قد أغفلنا إشارة بدء MYH2 في ألياف 2X التي تبدو نقية على مستوى الحمض النووي الريبوزي الرسول. أحد التفسيرات المحتملة، وإن كان افتراضيًا، هو الاختلافات في استقرار البروتين و/أو الحمض النووي الريبوزي الرسول بين نظائر MYH. في الواقع، لا توجد ألياف سريعة نقية بنسبة 100% لأي نظير من نظائر MYH، ومن غير الواضح ما إذا كانت مستويات التعبير الجيني لـ MYH1 في نطاق 70-90% ستؤدي إلى وفرة متساوية لـ MYH1 وMYH2 على مستوى البروتين. مع ذلك، عند النظر إلى كامل النسخ الجيني أو البروتيني، يمكن لتحليل التجميع أن يحدد بثقة مجموعتين متميزتين فقط تمثلان ألياف العضلات الهيكلية البطيئة والسريعة، بغض النظر عن تركيب MYH الدقيق. يتوافق هذا مع التحليلات التي تستخدم مناهج النسخ أحادية النواة، والتي عادةً ما تحدد مجموعتين متميزتين فقط من النوى العضلية. 68، 69، 70 علاوة على ذلك، على الرغم من أن الدراسات البروتينية السابقة قد حددت أليافًا من النوع 2X، فإن هذه الألياف لا تتجمع بشكل منفصل عن بقية الألياف السريعة، ولا تُظهر سوى عدد قليل من البروتينات ذات الوفرة المختلفة مقارنةً بأنواع الألياف الأخرى بناءً على جين MYH. 14 تشير هذه النتائج إلى أنه ينبغي لنا العودة إلى وجهة نظر أوائل القرن العشرين لتصنيف ألياف العضلات، والتي قسمت ألياف العضلات الهيكلية البشرية ليس إلى ثلاث فئات متميزة بناءً على جين MYH، ولكن إلى مجموعتين بناءً على خصائصها الأيضية والتقلصية. 63
والأهم من ذلك، ينبغي النظر إلى عدم تجانس الألياف العضلية من جوانب متعددة. وقد أشارت دراسات "الأوميكس" السابقة إلى هذا الاتجاه، موضحةً أن ألياف العضلات الهيكلية لا تُشكّل تجمعات منفصلة، ​​بل تتوزع على طول سلسلة متصلة. 11، 13، 14، 64، 71 نُبين هنا أنه بالإضافة إلى الاختلافات في الخصائص الانقباضية والأيضية للعضلات الهيكلية، يُمكن تمييز الألياف العضلية من خلال سمات تتعلق بالتفاعلات بين الخلايا وآليات الترجمة. في الواقع، وجدنا عدم تجانس في الريبوسومات في ألياف العضلات الهيكلية، وهو ما يُسهم في عدم التجانس بغض النظر عن نوع الألياف (بطيئة أو سريعة). لا يزال السبب الكامن وراء هذا التباين الكبير في ألياف العضلات، بغض النظر عن نوع الألياف البطيئة والسريعة، غير واضح، ولكنه قد يشير إلى تنظيم مكاني متخصص داخل حزم العضلات يستجيب على النحو الأمثل لقوى وأحمال محددة،⁷² أو تواصل خلوي أو عضوي متخصص مع أنواع أخرى من الخلايا في البيئة الدقيقة للعضلات،^73،74،75 أو اختلافات في نشاط الريبوسومات داخل ألياف العضلات الفردية. في الواقع، ثبت أن عدم تجانس الريبوسومات، سواء من خلال الاستبدال المتماثل لـ RPL3 وRPL3L أو على مستوى مثيلة 2′O للرنا الريبوسومي، مرتبط بتضخم العضلات الهيكلية،^76،77 إن التطبيقات متعددة الأوميات والتطبيقات المكانية، بالإضافة إلى التوصيف الوظيفي لألياف العضلات الفردية، ستعزز فهمنا لبيولوجيا العضلات على المستوى متعدد الأوميات.⁷⁸
من خلال تحليل البروتينات في ألياف عضلية مفردة من مرضى اعتلالات العضلات الخيطية، أثبتنا أيضًا فائدة وفعالية وتطبيق تحليل البروتينات في الألياف العضلية المفردة لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية السريرية للعضلات الهيكلية. علاوة على ذلك، بمقارنة منهجية عملنا بتحليل البروتينات الشامل، تمكنا من إثبات أن تحليل البروتينات في الألياف العضلية المفردة يوفر نفس مستوى المعلومات الذي يوفره تحليل البروتينات في الأنسجة، بل ويتجاوزه من خلال مراعاة التباين بين الألياف ونوع الألياف العضلية. بالإضافة إلى الاختلافات المتوقعة (وإن كانت متفاوتة) في نسبة أنواع الألياف التي لوحظت في اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1 مقارنةً بالأفراد الأصحاء، لاحظنا أيضًا إعادة تشكيل تأكسدية وخارج خلوية مستقلة عن تبديل نوع الألياف بوساطة MYH. سبق الإبلاغ عن وجود تليف في اعتلالات العضلات الخيطية TNNT1.¹⁹ ومع ذلك، فإن تحليلنا يُعزز هذه النتيجة من خلال الكشف أيضًا عن زيادة مستويات البروتينات المُفرزة خارج الخلية والمرتبطة بالإجهاد، مثل الأنكسينات، والتي تُشارك في آليات إصلاح غشاء الليف العضلي، في الألياف العضلية لدى مرضى اعتلالات العضلات الخيطية ACTA1 وTNNT1.^57،58،59 في الختام، قد تُمثل زيادة مستويات الأنكسين في الألياف العضلية لدى مرضى اعتلال العضلات الخيطية استجابة خلوية لإصلاح الألياف العضلية الضمورية بشدة.
على الرغم من أن هذه الدراسة تُعدّ أكبر تحليل شامل للألياف العضلية الكاملة لدى البشر حتى الآن، إلا أنها لا تخلو من بعض القيود. فقد عزلنا ألياف العضلات الهيكلية من عينة صغيرة ومتجانسة نسبيًا من المشاركين، ومن عضلة واحدة فقط (العضلة المتسعة الوحشية). لذا، يستحيل استبعاد وجود مجموعات ألياف محددة عبر أنواع العضلات المختلفة، وفي حالات فسيولوجيا العضلات القصوى. على سبيل المثال، لا يمكننا استبعاد احتمال ظهور مجموعة فرعية من الألياف فائقة السرعة (مثل ألياف 2X النقية) لدى العدائين ذوي التدريب العالي و/أو رياضيي القوة، أو خلال فترات الخمول العضلي. علاوة على ذلك، حال صغر حجم عينة المشاركين دون دراسة الاختلافات بين الجنسين في تباين الألياف، إذ من المعروف أن نسب أنواع الألياف تختلف بين الرجال والنساء. كما لم نتمكن من إجراء تحليلات النسخ والبروتينات على ألياف العضلات نفسها أو عينات من المشاركين أنفسهم. بينما نواصل نحن وغيرنا تحسين تحليلات الخلية الواحدة والألياف العضلية المفردة باستخدام تحليل الأوميكس لتحقيق مدخلات عينة منخفضة للغاية (كما هو موضح هنا في تحليل الألياف من المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلي ميتوكوندري)، تصبح فرصة الجمع بين مناهج الأوميكس المتعددة (والوظيفية) داخل ألياف عضلية مفردة واضحة.
بشكل عام، تُحدد بياناتنا وتُفسر العوامل المؤثرة على تباين ألياف العضلات الهيكلية، سواءً على مستوى النسخ أو ما بعد النسخ. وعلى وجه التحديد، نقدم بيانات تُشكك في مُسلّمة راسخة في علم وظائف الأعضاء للعضلات الهيكلية، والمرتبطة بالتعريف الكلاسيكي لأنواع الألياف بناءً على جين MYH. نأمل أن نُعيد إحياء النقاش، وأن نُعيد النظر في فهمنا لتصنيف ألياف العضلات الهيكلية وتباينها.
وافق أربعة عشر مشاركًا من ذوي البشرة البيضاء (12 رجلاً وامرأتان) طواعيةً على المشاركة في هذه الدراسة. وقد حظيت الدراسة بموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة غنت (BC-10237)، والتزمت بإعلان هلسنكي لعام 2013، وسُجّلت في موقع ClinicalTrials.gov (NCT05131555). تُعرض الخصائص العامة للمشاركين في الجدول التكميلي 1. بعد الحصول على موافقة شفهية وكتابية مستنيرة، خضع المشاركون لفحص طبي قبل إدراجهم النهائي في الدراسة. كان المشاركون شبابًا (تتراوح أعمارهم بين 22 و42 عامًا)، أصحاء (لا يعانون من أي أمراض، وليس لديهم تاريخ تدخين)، ونشطين بدنيًا بشكل معتدل. حُدِّد الحد الأقصى لاستهلاك الأكسجين باستخدام جهاز قياس الجهد البدني لتقييم اللياقة البدنية كما هو موضح سابقًا.⁸¹
جُمعت عينات خزعة العضلات في حالة الراحة والصيام ثلاث مرات، يفصل بين كل مرة وأخرى 14 يومًا. ولأن هذه العينات جُمعت كجزء من دراسة أوسع، تناول المشاركون دواءً وهميًا (لاكتوز)، أو مضادًا لمستقبلات الهيستامين H1 (540 ملغ فيكسوفينادين)، أو مضادًا لمستقبلات الهيستامين H2 (40 ملغ فاموتيدين) قبل 40 دقيقة من الخزعة. وقد سبق أن أثبتنا أن مضادات مستقبلات الهيستامين هذه لا تؤثر على لياقة العضلات الهيكلية في حالة الراحة⁸¹، ولم نلاحظ أي تكتل مرتبط بالحالة في مخططات مراقبة الجودة (الشكلان التكميليان 3 و6). وتم اتباع نظام غذائي موحد (41.4 سعرة حرارية/كغ من وزن الجسم، 5.1 غ/كغ من وزن الجسم كربوهيدرات، 1.4 غ/كغ من وزن الجسم بروتين، و1.6 غ/كغ من وزن الجسم دهون) لمدة 48 ساعة قبل كل يوم تجريبي، وتناول المشاركون وجبة إفطار موحدة (1.5 غ/كغ من وزن الجسم كربوهيدرات) صباح يوم التجربة. تحت التخدير الموضعي (0.5 مل من ليدوكايين 1٪ بدون إيبينفرين)، تم الحصول على خزعات عضلية من العضلة المتسعة الوحشية باستخدام شفط بيرجستروم عن طريق الجلد.82 تم تضمين عينات العضلات على الفور في RNAlater وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى تشريح الألياف اليدوي (حتى 3 أيام).
نُقلت حزم الألياف العضلية المعزولة حديثًا إلى وسط RNAlater طازج في طبق زراعة. ثم فُصلت الألياف العضلية يدويًا باستخدام مجهر ستيريو وملقط دقيق. فُصلت 25 ليفًا من كل خزعة، مع الحرص على اختيار الألياف من مناطق مختلفة من الخزعة. بعد الفصل، غُمر كل ليف برفق في 3 ميكرولتر من محلول التحلل (مجموعة SingleShot Cell Lysis Kit، Bio-Rad) الذي يحتوي على إنزيمات البروتينيز K والديوكسي ريبونيوكلياز لإزالة البروتينات والحمض النووي غير المرغوب فيها. ثم بُدئ تحلل الخلايا وإزالة البروتين/الحمض النووي عن طريق الخلط السريع، ثم تدوير السائل في جهاز طرد مركزي دقيق، والحضانة في درجة حرارة الغرفة (10 دقائق). بعد ذلك، حُضن المستخلص في جهاز تدوير حراري (T100، Bio-Rad) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم حُفظ فورًا عند -80 درجة مئوية لحين إجراء المزيد من المعالجة.
تم تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين المتوافقة مع تقنية Illumina من 2 ميكرولتر من مستخلص ألياف عضلية باستخدام مجموعة QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). يمكن الاطلاع على الطرق التفصيلية في دليل الشركة المصنعة. تبدأ العملية بتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى عن طريق النسخ العكسي، حيث يتم إدخال مُعرّفات جزيئية فريدة (UMIs) ورموز شريطية i1 خاصة بكل عينة لضمان تجميع العينات وتقليل التباين التقني أثناء المعالجة اللاحقة. بعد ذلك، يتم تجميع الحمض النووي التكميلي من 96 ليفًا عضليًا وتنقيته باستخدام خرز مغناطيسي، ثم يُزال الحمض النووي الريبوزي (RNA) ويتم تخليق السلسلة الثانية باستخدام بادئات عشوائية. تُنقى المكتبة باستخدام خرز مغناطيسي، وتُضاف علامات i5/i7 الخاصة بكل مجموعة، ويتم تضخيمها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تُنتج خطوة التنقية النهائية مكتبات متوافقة مع تقنية Illumina. تم تقييم جودة كل مجموعة مكتبة باستخدام مجموعة تحليل الحمض النووي ذات الحساسية العالية للقطع الصغيرة (Agilent Technologies، DNF-477-0500).
استنادًا إلى قياس الكميات باستخدام جهاز Qubit، تم تجميع العينات بشكل إضافي بتراكيز متساوية (2 نانومول). ثم تم تسلسل المجموعة الناتجة على جهاز NovaSeq 6000 في الوضع القياسي باستخدام مجموعة كواشف NovaSeq S2 (1 × 100 نيوكليوتيد) مع تحميل 2 نانومول (4% PhiX).
تعتمد منهجيتنا على منهجية تحليل بيانات QuantSeq Pool من Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). في البداية، تم فصل البيانات باستخدام bcl2fastq2 (الإصدار 2.20.0) بناءً على فهرس i7/i5. ثم تم فصل القراءة الثانية باستخدام idemux (الإصدار 0.1.6) بناءً على رمز العينة i1، واستُخرجت تسلسلات UMI باستخدام umi_tools (الإصدار 1.0.1). بعد ذلك، تم تقليم القراءات باستخدام cutadapt (الإصدار 3.4) على عدة مراحل لإزالة القراءات القصيرة (أقل من 20 بايت) أو القراءات التي تتكون فقط من تسلسلات المحولات. ثم تمت محاذاة القراءات مع الجينوم البشري باستخدام STAR (الإصدار 2.6.0c)، وفُهرست ملفات BAM باستخدام SAMtools (الإصدار 1.11). وأُزيلت القراءات المكررة باستخدام umi_tools (الإصدار 1.0.1). وأخيرًا، تم إجراء عدّ المحاذاة باستخدام برنامج featureCounts في Subread (الإصدار 2.0.3). وتم إجراء مراقبة الجودة باستخدام برنامج FastQC (الإصدار 0.11.9) في عدة مراحل وسيطة من عملية المعالجة.
أُجريت جميع عمليات المعالجة والتصوير المعلوماتي الحيوي اللاحقة باستخدام برنامج R (الإصدار 4.2.3)، وبالاعتماد بشكل أساسي على سير عمل Seurat (الإصدار 4.4.0).⁸³ ولذلك، حُوِّلت قيم UMI الفردية ومصفوفات البيانات الوصفية إلى كائنات Seurat. وتم استبعاد الجينات المُعبَّر عنها في أقل من 30% من جميع الألياف. كما تم استبعاد العينات منخفضة الجودة بناءً على حد أدنى قدره 1000 قيمة UMI و1000 جين مُكتشف. وفي النهاية، اجتازت 925 ليفًا جميع خطوات ترشيح مراقبة الجودة. وتمت معايرة قيم UMI باستخدام طريقة Seurat SCTransform v2،⁸⁴ بما في ذلك جميع الميزات المُكتشفة البالغ عددها 7418، وتم استبعاد الفروق بين المشاركين. ويمكن الاطلاع على جميع البيانات الوصفية ذات الصلة في مجموعة البيانات التكميلية رقم 28.