نواة لبية ذاتية المزروعة في العظم تحت الغضروفي القطني لإنشاء نموذج حيواني للتغيرات المعدلة

شكرا لكم لزيارة Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام متصفح أحدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
يعد إنشاء نماذج حيوانية للتغيير المعدل (MC) أساسًا مهمًا لدراسة MC. تم تقسيم أربعة وخمسين أرنبًا نيوزيلنديًا أبيضًا إلى مجموعة العمليات الوهمية ومجموعة زرع العضلات (مجموعة ME) ومجموعة زرع النواة اللبية (مجموعة NPE). في مجموعة NPE، تم كشف القرص الفقري عن طريق النهج الجراحي القطني الأمامي الجانبي وتم استخدام إبرة لثقب الجسم الفقري L5 بالقرب من لوحة النهاية. تم استخراج NP من القرص الفقري L1/2 بواسطة حقنة وحقنه فيه. حفر حفرة في العظم تحت الغضروفي. كانت الإجراءات الجراحية وطرق الحفر في مجموعة زرع العضلات ومجموعة العمليات الوهمية هي نفسها الموجودة في مجموعة زرع NP. في مجموعة العمليات الجراحية، تم وضع قطعة من العضلات في الحفرة، بينما في مجموعة العمليات الوهمية، لم يتم وضع أي شيء في الحفرة. بعد العملية، تم إجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي والاختبار البيولوجي الجزيئي. تغيرت الإشارة في مجموعة NPE، ولكن لم يكن هناك تغيير واضح في الإشارة في مجموعة العمليات الوهمية ومجموعة ME. أظهرت الملاحظة النسيجية أنه تم ملاحظة تكاثر غير طبيعي للأنسجة في موقع الزرع، وزاد التعبير عن IL-4 وIL-17 وIFN-γ في مجموعة NPE. يمكن أن يشكل زرع NP في العظم تحت الغضروفي نموذجًا حيوانيًا لـ MC.
التغيرات المعدلة (MC) هي آفات في الصفائح الفقرية ونخاع العظم المجاور مرئية في التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وهي شائعة جدًا لدى الأفراد الذين يعانون من الأعراض المرتبطة بها. وقد أكدت العديد من الدراسات على أهمية MC بسبب ارتباطه بآلام أسفل الظهر (LBP)2،3. وصف دي روس وآخرون 4 وموديتش وآخرون 5 بشكل مستقل ثلاثة أنواع مختلفة من تشوهات الإشارة تحت الغضروفية في نخاع العظم الفقري. تغييرات النوع الأول هي انخفاض الشدة على تسلسلات T1 الموزونة (T1W) وفرط الشدة على تسلسلات T2 الموزونة (T2W). تكشف هذه الآفة عن الصفائح الطرفية الشقية والأنسجة الحبيبية الوعائية المجاورة في نخاع العظم. تُظهر تغييرات Modic type II إشارة عالية في كل من تسلسلي T1W وT2W. في هذا النوع من الآفات، يمكن العثور على تدمير الصفيحة النهائية، بالإضافة إلى الاستبدال الدهني النسيجي لنخاع العظم المجاور. تُظهر تغييرات Modic type III إشارة منخفضة في تسلسلات T1W وT2W. وقد لوحظت الآفات المتصلبة المقابلة للألواح النهائية6. يعتبر MC مرضًا مرضيًا في العمود الفقري ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بالعديد من الأمراض التنكسية في العمود الفقري .
وبالنظر إلى البيانات المتاحة، قدمت العديد من الدراسات رؤى مفصلة حول المسببات والآليات المرضية للMC. ألبرت وآخرون. اقترح أن MC قد يكون ناجما عن فتق القرص 8. هو وآخرون. يعزى MC إلى انحطاط القرص الشديد . اقترح كروك مفهوم "تمزق القرص الداخلي"، والذي ينص على أن صدمة القرص المتكررة قد تؤدي إلى تمزقات دقيقة في الصفيحة النهائية. بعد تكوين الشق، قد يؤدي تدمير الصفيحة النهائية بواسطة النواة اللبية (NP) إلى تحفيز استجابة مناعية ذاتية، مما يؤدي أيضًا إلى تطور MC11. ما وآخرون. شاركت وجهة نظر مماثلة وذكرت أن المناعة الذاتية الناجمة عن NP تلعب دورًا رئيسيًا في التسبب في MC12.
تلعب خلايا الجهاز المناعي، وخاصة الخلايا الليمفاوية المساعدة CD4 + T، دورًا حاسمًا في التسبب في المناعة الذاتية. تنتج المجموعة الفرعية Th17 المكتشفة مؤخرًا السيتوكين المسببة للالتهابات IL-17، وتعزز التعبير الكيميائي، وتحفز الخلايا التائية في الأعضاء التالفة لإنتاج IFN-γ14. تلعب خلايا Th2 أيضًا دورًا فريدًا في التسبب في الاستجابات المناعية. يمكن أن يؤدي التعبير عن IL-4 كخلية Th2 تمثيلية إلى عواقب مرضية مناعية شديدة.
على الرغم من إجراء العديد من الدراسات السريرية على MC16،17،18،19،20،21،22،23،24، لا يزال هناك نقص في النماذج التجريبية الحيوانية المناسبة التي يمكن أن تحاكي عملية MC التي تحدث بشكل متكرر عند البشر ويمكن أن تكون تستخدم للتحقيق في المسببات أو العلاجات الجديدة مثل العلاج الموجه. حتى الآن، تم الإبلاغ عن عدد قليل فقط من النماذج الحيوانية لـ MC لدراسة الآليات المرضية الأساسية.
استنادًا إلى نظرية المناعة الذاتية التي اقترحها ألبرت وما، أنشأت هذه الدراسة نموذجًا بسيطًا وقابل للتكرار للأرنب MC عن طريق زرع NP ذاتيًا بالقرب من لوحة نهاية العمود الفقري المحفورة. وتتمثل الأهداف الأخرى في مراقبة الخصائص النسيجية للنماذج الحيوانية وتقييم الآليات المحددة للـ NP في تطوير MC. ولتحقيق هذه الغاية، نستخدم تقنيات مثل البيولوجيا الجزيئية، والتصوير بالرنين المغناطيسي، والدراسات النسيجية لدراسة تطور MC.
مات اثنان من الأرانب بسبب النزيف أثناء الجراحة، ومات أربعة أرانب أثناء التخدير أثناء التصوير بالرنين المغناطيسي. ونجا الأرانب الـ 48 المتبقية ولم تظهر عليهم أي علامات سلوكية أو عصبية بعد الجراحة.
يُظهر التصوير بالرنين المغناطيسي أن شدة إشارة الأنسجة المدمجة في الثقوب المختلفة تختلف. تغيرت شدة إشارة الجسم الفقري L5 في مجموعة NPE تدريجيًا عند 12 و16 و20 أسبوعًا بعد الإدخال (أظهر تسلسل T1W إشارة منخفضة، وأظهر تسلسل T2W إشارة مختلطة بالإضافة إلى إشارة منخفضة) (الشكل 1C)، بينما ظهر التصوير بالرنين المغناطيسي من المجموعتين الأخريين من الأجزاء المدمجة ظلت مستقرة نسبيا خلال نفس الفترة (الشكل 1A، B).
(أ) التصوير بالرنين المغناطيسي التمثيلي المتسلسل للعمود الفقري القطني للأرنب في 3 نقاط زمنية. لم يتم العثور على أي تشوهات في الإشارة في صور مجموعة العمليات الوهمية. (ب) تتشابه خصائص إشارة الجسم الفقري في مجموعة ME مع تلك الموجودة في مجموعة العمليات الصورية، ولم يلاحظ أي تغيير كبير في الإشارة في موقع التضمين مع مرور الوقت. (C) في مجموعة NPE، تكون الإشارة المنخفضة مرئية بوضوح في تسلسل T1W، وتكون الإشارة المختلطة والإشارة المنخفضة مرئية بوضوح في تسلسل T2W. ومن فترة 12 أسبوعًا إلى فترة 20 أسبوعًا، تتناقص الإشارات العالية المتفرقة المحيطة بالإشارات المنخفضة في تسلسل T2W.
يمكن رؤية تضخم العظام الواضح في موقع زرع الجسم الفقري في مجموعة NPE، ويحدث تضخم العظام بشكل أسرع من 12 إلى 20 أسبوعًا (الشكل 2C) مقارنة بمجموعة NPE، ولم يلاحظ أي تغيير كبير في العمود الفقري النموذجي الهيئات؛ مجموعة الشام ومجموعة ME (الشكل 2C) 2A،B).
(أ) يكون سطح الجسم الفقري في الجزء المزروع أملسًا جدًا، ويلتئم الثقب جيدًا، ولا يوجد تضخم في الجسم الفقري. (ب) شكل الموقع المزروع في مجموعة ME يشبه ذلك الموجود في مجموعة العمليات الوهمية، ولا يوجد أي تغيير واضح في مظهر الموقع المزروع مع مرور الوقت. (ج) حدث تضخم العظام في الموقع المزروع في مجموعة NPE. زاد تضخم العظام بسرعة وامتد عبر القرص الفقري إلى الجسم الفقري المقابل.
يوفر التحليل النسيجي معلومات أكثر تفصيلاً حول تكوين العظام. ويبين الشكل 3 صور أقسام ما بعد الجراحة الملطخة بـ H&E. في مجموعة العمليات الصورية، كانت الخلايا الغضروفية مرتبة جيدًا ولم يتم اكتشاف أي تكاثر للخلايا (الشكل 3A). كان الوضع في مجموعة ME مشابهًا للوضع في مجموعة العمليات الوهمية (الشكل 3 ب). ومع ذلك، في مجموعة NPE، لوحظ عدد كبير من الخلايا الغضروفية وانتشار الخلايا الشبيهة بـ NP في موقع الزرع (الشكل 3C)؛
(أ) يمكن رؤية التربيق بالقرب من الصفيحة النهائية، حيث يتم ترتيب الخلايا الغضروفية بدقة مع حجم وشكل خلية موحدين وعدم تكاثرها (40 مرة). (ب) حالة موقع الزرع في المجموعة ME مشابهة لحالة المجموعة الوهمية. يمكن رؤية التربيق والخلايا الغضروفية، ولكن لا يوجد تكاثر واضح في موقع الزرع (40 مرة). (ب) يمكن ملاحظة أن الخلايا الغضروفية والخلايا الشبيهة بـ NP تتكاثر بشكل كبير، وأن شكل وحجم الخلايا الغضروفية غير متساويين (40 مرة).
وقد لوحظ التعبير عن الإنترلوكين 4 (IL-4) mRNA، والإنترلوكين 17 (IL-17) mRNA، والإنترفيرون γ (IFN-γ) mRNA في كل من مجموعتي NPE وME. عندما تمت مقارنة مستويات التعبير للجينات المستهدفة، زادت التعبيرات الجينية لـ IL-4 و IL-17 و IFN-γ بشكل ملحوظ في مجموعة NPE مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة ME ومجموعة العمليات الوهمية (الشكل 4). (ف <0.05). بالمقارنة مع مجموعة العمليات الوهمية، زادت مستويات التعبير عن IL-4 وIL-17 وIFN-γ في مجموعة ME بشكل طفيف فقط ولم تصل إلى تغيير إحصائي (P > 0.05).
أظهر تعبير mRNA لـ IL-4 و IL-17 و IFN-γ في مجموعة NPE اتجاهًا أعلى بكثير من تلك الموجودة في مجموعة العمليات الوهمية ومجموعة ME (P <0.05).
في المقابل، لم تظهر مستويات التعبير في المجموعة ME أي فرق كبير (P > 0.05).
تم إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريًا ضد IL-4 وIL-17 لتأكيد نمط تعبير mRNA المتغير. كما هو مبين في الأشكال 5A، B، مقارنة مع مجموعة ME ومجموعة العمليات الوهمية، زادت مستويات البروتين IL-4 وIL-17 في مجموعة NPE بشكل ملحوظ (P <0.05). بالمقارنة مع مجموعة العمليات الوهمية، فشلت أيضًا مستويات البروتين IL-4 وIL-17 في مجموعة ME في الوصول إلى تغييرات ذات دلالة إحصائية (P > 0.05).
(أ) كانت مستويات البروتين لـ IL-4 وIL-17 في مجموعة NPE أعلى بكثير من تلك الموجودة في مجموعة ME ومجموعة الدواء الوهمي (P <0.05). (ب) الرسم البياني لطخة غربية.
نظراً للعدد المحدود من العينات البشرية التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة، فإن الدراسات الواضحة والمفصلة حول التسبب في مرض MC صعبة إلى حد ما. لقد حاولنا إنشاء نموذج حيواني لـ MC لدراسة آلياته المرضية المحتملة. في الوقت نفسه، تم استخدام التقييم الإشعاعي والتقييم النسيجي والتقييم البيولوجي الجزيئي لمتابعة مسار MC الناجم عن الطعم الذاتي NP. ونتيجة لذلك، أدى نموذج زرع NP إلى تغيير تدريجي في شدة الإشارة من نقاط زمنية مدتها 12 أسبوعًا إلى 20 أسبوعًا (إشارة منخفضة مختلطة في تسلسل T1W وإشارة منخفضة في تسلسل T2W)، مما يشير إلى تغيرات الأنسجة، والتغيرات النسيجية والجزيئية. وأكدت التقييمات البيولوجية نتائج الدراسة الإشعاعية.
تظهر نتائج هذه التجربة حدوث تغيرات بصرية ونسيجية في موقع انتهاك الجسم الفقري في مجموعة NPE. في الوقت نفسه، لوحظ التعبير عن جينات IL-4 وIL-17 وIFN-γ، وكذلك IL-4 وIL-17 وIFN-γ، مما يشير إلى انتهاك أنسجة النواة اللبية الذاتية في العمود الفقري. قد يسبب الجسم سلسلة من التغيرات الإشارة والمورفولوجية. من السهل أن نجد أن خصائص الإشارة للأجسام الفقرية في النموذج الحيواني (إشارة منخفضة في تسلسل T1W، إشارة مختلطة وإشارة منخفضة في تسلسل T2W) تشبه إلى حد كبير خصائص الخلايا الفقارية البشرية، وخصائص التصوير بالرنين المغناطيسي أيضًا تأكيد ملاحظات الأنسجة والتشريح الإجمالي، أي أن التغييرات في خلايا الجسم الفقري تقدمية. على الرغم من أن الاستجابة الالتهابية الناجمة عن الصدمة الحادة قد تظهر بعد وقت قصير من الثقب، فقد أظهرت نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي أن التغيرات المتزايدة تدريجياً في الإشارة ظهرت بعد 12 أسبوعًا من الثقب واستمرت لمدة تصل إلى 20 أسبوعًا دون أي علامات للتعافي أو عكس تغييرات التصوير بالرنين المغناطيسي. تشير هذه النتائج إلى أن NP الفقري الذاتي هو وسيلة موثوقة لإنشاء MV التدريجي في الأرانب.
يتطلب نموذج الثقب هذا مهارة كافية ووقتًا وجهدًا جراحيًا. في التجارب الأولية، قد يؤدي التشريح أو التحفيز المفرط للهياكل الرباطية المجاورة للفقرة إلى تكوين النابتات العظمية الفقرية. يجب الحرص على عدم إتلاف أو تهيج الأقراص المجاورة. وبما أنه يجب التحكم في عمق الاختراق للحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار، فقد صنعنا سدادة يدويًا عن طريق قطع غمد إبرة طويلة يبلغ طولها 3 مم. يضمن استخدام هذا القابس عمق حفر موحد في الجسم الفقري. في التجارب الأولية، وجد ثلاثة جراحي عظام مشاركين في العملية أن استخدام إبر قياس 16 أسهل من استخدام إبر قياس 18 أو طرق أخرى. لتجنب النزيف المفرط أثناء الحفر، فإن الضغط على الإبرة لفترة من الوقت سيوفر ثقب إدخال أكثر ملاءمة، مما يشير إلى أنه يمكن التحكم في درجة معينة من MC بهذه الطريقة.
على الرغم من أن العديد من الدراسات استهدفت MC، إلا أنه لا يُعرف سوى القليل عن المسببات المرضية والتسبب في MC25،26،27. بناءً على دراساتنا السابقة، وجدنا أن المناعة الذاتية تلعب دورًا رئيسيًا في حدوث وتطور MC12. تناولت هذه الدراسة التعبير الكمي لـ IL-4، وIL-17، وIFN-γ، وهي مسارات التمايز الرئيسية لخلايا CD4+ بعد تحفيز المستضد. في دراستنا، مقارنة بالمجموعة السلبية، كان لدى مجموعة NPE تعبير أعلى عن IL-4 وIL-17 وIFN-γ، وكانت مستويات البروتين IL-4 وIL-17 أعلى أيضًا.
سريريًا، يتم زيادة التعبير IL-17 mRNA في خلايا NP من المرضى الذين يعانون من فتق القرص. تم العثور أيضًا على زيادة في مستويات التعبير IL-4 وIFN-γ في نموذج فتق القرص الحاد غير الضاغط مقارنةً بالضوابط الصحية. يلعب IL-17 دورًا رئيسيًا في الالتهاب وإصابة الأنسجة في أمراض المناعة الذاتية 30 ويعزز الاستجابة المناعية لـ IFN-γ31. تم الإبلاغ عن إصابة الأنسجة المحسنة بوساطة IL-17 في الفئران MRL / lpr والفئران المعرضة للمناعة الذاتية . يمكن أن يمنع IL-4 التعبير عن السيتوكينات المسببة للالتهابات (مثل IL-1β وTNFα) وتنشيط البلاعم. تم الإبلاغ عن أن تعبير mRNA لـ IL-4 كان مختلفًا في مجموعة NPE مقارنةً بـ IL-17 وIFN-γ في نفس النقطة الزمنية؛ كان تعبير mRNA لـ IFN-γ في مجموعة NPE أعلى بكثير من ذلك الموجود في المجموعات الأخرى. ولذلك، فإن إنتاج IFN-γ قد يكون وسيطًا للاستجابة الالتهابية الناجمة عن إقحام NP. أظهرت الدراسات أن IFN-γ يتم إنتاجه بواسطة أنواع متعددة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة من النوع الأول المنشطة، والخلايا القاتلة الطبيعية، والبلاعم35،36، وهو السيتوكين الرئيسي المؤيد للالتهابات الذي يعزز الاستجابات المناعية37.
تشير هذه الدراسة إلى أن استجابة المناعة الذاتية قد تكون متورطة في حدوث وتطور MC. لوما وآخرون. وجدت أن خصائص إشارة MC وNP البارزة متشابهة في التصوير بالرنين المغناطيسي، وكلاهما يُظهر إشارة عالية في تسلسل T2W. تم التأكد من أن بعض السيتوكينات مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بحدوث MC، مثل IL-139. ما وآخرون. اقترح أن نتوء NP لأعلى أو لأسفل قد يكون له تأثير كبير على حدوث وتطور MC12. أفاد Bobechko40 وHerzbein et al.41 أن NP هو نسيج مقاوم للمناعة ولا يمكنه دخول الدورة الدموية منذ الولادة. تُدخل نتوءات NP أجسامًا غريبة إلى إمداد الدم، وبالتالي تتوسط تفاعلات المناعة الذاتية المحلية. يمكن أن تحفز تفاعلات المناعة الذاتية عددًا كبيرًا من العوامل المناعية، وعندما تتعرض هذه العوامل بشكل مستمر للأنسجة، فإنها يمكن أن تسبب تغييرات في الإشارة. في هذه الدراسة، يعتبر الإفراط في التعبير عن IL-4 وIL-17 وIFN-γ من العوامل المناعية النموذجية، مما يثبت العلاقة الوثيقة بين NP وMCs44. هذا النموذج الحيواني يحاكي بشكل جيد اختراق NP والدخول إلى لوحة النهاية. كشفت هذه العملية أيضًا عن تأثير المناعة الذاتية على MC.
كما هو متوقع، هذا النموذج الحيواني يوفر لنا منصة محتملة لدراسة MC. ومع ذلك، لا يزال هذا النموذج لديه بعض القيود: أولاً، خلال مرحلة مراقبة الحيوانات، تحتاج بعض الأرانب في المرحلة المتوسطة إلى القتل الرحيم لاختبار البيولوجيا النسيجية والجزيئية، لذلك "تخرج بعض الحيوانات من الاستخدام" بمرور الوقت. ثانيًا، على الرغم من تحديد ثلاث نقاط زمنية في هذه الدراسة، لسوء الحظ، قمنا بتصميم نوع واحد فقط من MC (نوع Modic I تغيير)، لذلك لا يكفي تمثيل عملية تطور المرض البشري، ويجب تعيين المزيد من النقاط الزمنية لـ مراقبة أفضل لجميع التغييرات إشارة. ثالثا، يمكن بالفعل أن تظهر التغييرات في بنية الأنسجة بوضوح من خلال تلطيخ النسيجي، ولكن بعض التقنيات المتخصصة يمكن أن تكشف بشكل أفضل عن التغيرات المجهرية في هذا النموذج. على سبيل المثال، تم استخدام المجهر الضوئي المستقطب لتحليل تكوين الغضروف الليفي في أقراص الأرانب الفقرية. تتطلب التأثيرات طويلة المدى لـ NP على MC واللوحة النهائية مزيدًا من الدراسة.
تم تقسيم أربعة وخمسين من الأرانب البيضاء النيوزيلندية الذكور (وزن حوالي 2.5-3 كجم، عمر 3-3.5 أشهر) بشكل عشوائي إلى مجموعة عمليات صورية، مجموعة زرع العضلات (مجموعة ME) ومجموعة زرع جذر العصب (مجموعة NPE). تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تيانجين، وتم تنفيذ الأساليب التجريبية بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المعتمدة.
تم إجراء بعض التحسينات على التقنية الجراحية لـ S. Sobajima 46 . تم وضع كل أرنب في وضع الاستلقاء الجانبي وتم كشف السطح الأمامي لخمسة أقراص فقرية قطنية متتالية (IVDs) باستخدام نهج خلف الصفاق الخلفي الوحشي. تم إعطاء كل أرنب تخديرًا عامًا (20% يوريتان، 5 مل/كجم عبر وريد الأذن). تم إجراء شق طولي في الجلد من الحافة السفلية للأضلاع إلى حافة الحوض، ومسافة 2 سم من البطن إلى العضلات المجاورة للفقرة. تم كشف العمود الفقري الأمامي الجانبي الأيمن من L1 إلى L6 عن طريق تشريح حاد وصريح للأنسجة تحت الجلد المغطاة والأنسجة خلف الصفاق والعضلات (الشكل 6A). تم تحديد مستوى القرص باستخدام حافة الحوض كمعلم تشريحي لمستوى القرص L5-L6. استخدم إبرة ثقب قياس 16 لحفر ثقب بالقرب من اللوحة النهائية للفقرة L5 على عمق 3 مم (الشكل 6ب). استخدم حقنة سعة 5 مل لاستنشاق النواة اللبية الذاتية في القرص الفقري L1-L2 (الشكل 6C). إزالة النواة اللبية أو العضلة حسب متطلبات كل مجموعة. بعد تعميق ثقب الحفر، يتم وضع الغرز القابلة للامتصاص على اللفافة العميقة واللفافة السطحية والجلد، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة السمحاقية للجسم الفقري أثناء الجراحة.
(أ) يتم كشف القرص L5 – L6 عبر نهج خلف الصفاق الخلفي الوحشي. (ب) استخدم إبرة قياس 16 لحفر حفرة بالقرب من اللوحة النهائية L5. (ج) يتم حصاد MFs ذاتي.
تم إعطاء التخدير العام باستخدام 20٪ يوريتان (5 مل / كجم) عن طريق الوريد الأذن، وتم تكرار الصور الشعاعية للعمود الفقري القطني في 12 و 16 و 20 أسبوعًا بعد العمل الجراحي.
تمت التضحية بالأرانب عن طريق الحقن العضلي للكيتامين (25.0 مجم / كجم) وبنتوباربيتال الصوديوم في الوريد (1.2 جم / كجم) بعد 12 و 16 و 20 أسبوعًا من الجراحة. تمت إزالة العمود الفقري بأكمله للتحليل النسيجي وتم إجراء تحليل حقيقي. تم استخدام النسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) والنشاف الغربي للكشف عن التغيرات في العوامل المناعية.
تم إجراء فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي في الأرانب باستخدام مغناطيس سريري 3.0 T (GE Medical Systems، Florence، SC) مجهز بجهاز استقبال لفائف الأطراف المتعامد. تم تخدير الأرانب باستخدام 20٪ يوريتان (5 مل / كجم) عبر وريد الأذن ثم تم وضعها مستلقية داخل المغناطيس مع تركيز المنطقة القطنية على ملف سطحي دائري قطره 5 بوصات (GE Medical Systems). تم الحصول على صور المترجم الإكليلي T2 (TR، 1445 مللي ثانية؛ TE، 37 مللي ثانية) لتحديد موقع القرص القطني من L3 – L4 إلى L5 – L6. تم الحصول على شرائح الوزن السهمي T2 بالإعدادات التالية: تسلسل صدى الدوران السريع مع وقت تكرار (TR) يبلغ 2200 مللي ثانية ووقت صدى (TE) يبلغ 70 مللي ثانية، مصفوفة؛ المجال البصري 260 وثمانية المحفزات؛ كان سمك القطع 2 مم، وكانت الفجوة 0.2 مم.
بعد التقاط الصورة الأخيرة وقتل آخر أرنب، تمت إزالة الأقراص الزائفة والمضمنة في العضلات والأقراص NP للفحص النسيجي. تم إصلاح الأنسجة في 10٪ من الفورمالين المحايد المخزن لمدة أسبوع واحد، وتم إزالة الكالسيوم باستخدام حمض الإيثيلين ثنائي أمين رباعي الأسيتيك، وتقسيم البارافين. تم تضمين كتل الأنسجة في البارافين وتقطيعها إلى أقسام سهمية (بسمك 5 ميكرون) باستخدام مشراح. كانت المقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E).
بعد جمع الأقراص الفقرية من الأرانب في كل مجموعة، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام عمود UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd.، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ونظام النسخ العكسي ImProm II (Promega Inc. ، ماديسون، ويسكونسن، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء النسخ العكسي.
تم إجراء RT-qPCR باستخدام Prism 7300 (Applied Biosystems Inc.، USA) وSYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كان حجم تفاعل PCR 20 ميكرولتر ويحتوي على 1.5 ميكرولتر من [كدنا] المخفف و 0.2 ميكرومتر من كل جهاز تمهيدي. تم تصميم الاشعال بواسطة OligoPerfect Designer (Invitrogen، Valley، CA) وتم تصنيعه بواسطة شركة Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (الصين) (الجدول 1). تم استخدام شروط التدوير الحراري التالية: خطوة تنشيط البلمرة الأولية عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم 40 دورة مدة كل منها 15 ثانية عند 94 درجة مئوية لتغيير طبيعة القالب، والتليين لمدة دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية، والتمديد، والفلورة. تم إجراء القياسات لمدة دقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية. تم تضخيم جميع العينات ثلاث مرات وتم استخدام متوسط ​​القيمة لتحليل RT-qPCR. تم تحليل بيانات التضخيم باستخدام FlexStation 3 (Molecular Devices، Sunnyvale، CA، USA). تم تطبيع التعبير الجيني IL-4 و IL-17 و IFN-γ للتحكم الداخلي (ACTB). تم حساب مستويات التعبير النسبي للmRNA المستهدف باستخدام طريقة 2-ΔΔCT.
تم استخلاص البروتين الكلي من الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة في المخزن المؤقت لتحلل RIPA (الذي يحتوي على كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز) ثم طرده عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الأنسجة. تم تحميل خمسين ميكروغرامًا من البروتين لكل حارة، مفصولة بنسبة 10٪ SDS-PAGE، ثم تم نقلها إلى غشاء PVDF. تم إجراء الحظر في حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي تريس (TBS) يحتوي على 0.1٪ توين 20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تحضين الغشاء بجسم مضاد أولي للأرنب مضاد للديكورين (مخفف 1: 200 ؛ بوستر ، ووهان ، الصين) (مخفف 1: 200 ؛ بيوس ، بكين ، الصين) طوال الليل عند 4 درجات مئوية وتفاعل في الأيام الثانية ؛ مع الجسم المضاد الثانوي (الجلوبيولين المناعي المضاد للأرنب G عند تخفيف 1: 40000) مع بيروكسيداز الفجل الحار (بوستر، ووهان، الصين) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن إشارات لطخة غربية عن طريق زيادة اللمعان الكيميائي على الغشاء الكيميائي بعد تشعيع الأشعة السينية. لتحليل قياس الكثافة، تم مسح البقع وقياسها باستخدام برنامج BandScan وتم التعبير عن النتائج كنسبة مناعة الجينات المستهدفة إلى مناعة توبولين.
تم إجراء الحسابات الإحصائية باستخدام حزمة البرامج SPSS16.0 (SPSS، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعبير عن البيانات التي تم جمعها خلال الدراسة على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(يعني ± SD) وتم تحليلها باستخدام تحليل المقاييس المتكررة أحادية الاتجاه للتباين (ANOVA) لتحديد الاختلافات بين المجموعتين. اعتبرت P <0.05 ذات دلالة إحصائية.
وبالتالي، فإن إنشاء نموذج حيواني للـ MC عن طريق زرع NPs ذاتي في الجسم الفقري وإجراء المراقبة التشريحية الكلية وتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي والتقييم النسيجي والتحليل البيولوجي الجزيئي قد يصبح أداة مهمة لتقييم وفهم آليات MC البشرية وتطوير علاجات جديدة. التدخلات.
كيفية الاستشهاد بهذه المقالة : Han، C. et al. تم إنشاء نموذج حيواني للتغيرات Modic عن طريق زرع النواة اللبية الذاتية في العظم تحت الغضروفي في العمود الفقري القطني. الخيال العلمي. النائب 6، 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt، D.، Zanetti، M.، Hodler، J.، and Boos، N. التصوير بالرنين المغناطيسي للعمود الفقري القطني: انتشار فتق القرص والاحتفاظ به، وضغط جذر العصب، وتشوهات اللوحة النهائية، والتهاب المفاصل العظمي الوجهي لدى متطوعين بدون أعراض . معدل. الأشعة 209، 661-666، دوى:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer، P.، Korsholm، L.، Bendix، T.، Sorensen، JS، and Leboeuf-Eed، K. Modic التغييرات وعلاقتها بالنتائج السريرية. مجلة العمود الفقري الأوروبية: منشور رسمي للجمعية الأوروبية للعمود الفقري، والجمعية الأوروبية لتشوه العمود الفقري، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري العنقي 15، 1312-1319، دوى: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
كويزما، M.، وآخرون. التغيرات المعدلة في الصفائح الفقرية القطنية: الانتشار والارتباط بألم أسفل الظهر وعرق النسا لدى العمال الذكور في منتصف العمر. العمود الفقري 32، 1116-1122، دوى:10.1097 / 01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos، A.، Kressel، H.، Spritzer، K.، and Dalinka، M. MRI لنخاع العظم يتغير بالقرب من لوحة النهاية في الأمراض التنكسية للعمود الفقري القطني. أجر. المجلة الأمريكية للأشعة 149، 531-534، دوى: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic، MT، Steinberg، PM، Ross، JS، Masaryk، TJ، and Carter، JR مرض القرص التنكسي: تقييم تغيرات النخاع الفقري باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي. الأشعة 166، 193-199، دوى:10.1148 / Radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic، MT، Masaryk، TJ، Ross، JS، and Carter، JR تصوير مرض القرص التنكسية. الأشعة 168، 177-186، دوى: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
جنسن، تيسي، وآخرون. تشير المتنبئون بالصفيحة الفقرية الحديثة (Modic) إلى تغيرات في عموم السكان. مجلة العمود الفقري الأوروبية: منشور رسمي للجمعية الأوروبية للعمود الفقري، والجمعية الأوروبية لتشوه العمود الفقري، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري العنقي، القسم 19، 129-135، دوى: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
يتغير ألبرت، HB ومانيش، K. Modic بعد فتق القرص القطني. مجلة العمود الفقري الأوروبية: منشور رسمي للجمعية الأوروبية للعمود الفقري، والجمعية الأوروبية لتشوه العمود الفقري والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري العنقي 16، 977-982، دوى: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula، L.، Luoma، K.، Vehmas، T.، Gronblad، M.، and Kaapa، E. Modic type I يمكن أن تتنبأ التغييرات بسرعة انحطاط القرص التشوهي التدريجي: دراسة مستقبلية مدتها عام واحد. مجلة العمود الفقري الأوروبية 21، 1135-1142، دوى: 10.1007 / s00586-012-2147-9 (2012).
تغييرات Hu، ZJ، Zhao، FD، Fang، XQ and Fan، SW Modic: الأسباب المحتملة والمساهمة في تنكس القرص القطني. الفرضيات الطبية 73، 930-932، دوى: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
كروك، HV تمزق القرص الداخلي. مشاكل هبوط القرص على مدى 50 عاما. العمود الفقري (فيلا با 1976) 11، 650-653 (1986).