اللب النووي الذاتي المزروع في عظم تحت الجسور القطني لإنشاء نموذج حيوانية من التغييرات المعدلة

شكرا لك على زيارة nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه له دعم محدود CSS. للحصول على أفضل النتائج ، نوصي باستخدام متصفح أحدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في غضون ذلك ، لضمان الدعم المستمر ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
يعد إنشاء النماذج الحيوانية للتغيير المعدل (MC) أساسًا مهمًا لدراسة MC. تم تقسيم أربعة وخمسين من الأرانب البيضاء في نيوزيلندا إلى مجموعة تعاون الخار ، مجموعة زرع العضلات (مجموعة ME) ومجموعة زراعة اللب النووي (NPE Group). في مجموعة NPE ، تعرض القرص الفقري من خلال النهج الجراحي القطني الأمامي الخلفي وتم استخدام إبرة لثقب الجسم الفقري L5 بالقرب من اللوحة النهائية. تم استخراج NP من القرص الفقري L1/2 بواسطة حقنة وحقنها. حفر حفرة في عظم شبه الجرح. كانت الإجراءات الجراحية وطرق الحفر في مجموعة زرع العضلات ومجموعة الشحوم هي نفسها تلك الموجودة في مجموعة زرع NP. في مجموعة Me ، تم وضع قطعة من العضلات في الحفرة ، بينما في مجموعة الشحوم ، لم يتم وضع أي شيء في الحفرة. بعد العملية ، تم إجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي والاختبارات البيولوجية الجزيئية. تغيرت الإشارة في مجموعة NPE ، ولكن لم يكن هناك تغيير واضح في الإشارة في مجموعة Operation و Group ME. أظهرت الملاحظة النسيجية أن تكاثر الأنسجة غير الطبيعية لوحظ في موقع الزرع ، وتم زيادة التعبير عن IL-4 و IL-17 و IFN-γ في مجموعة NPE. يمكن أن يشكل زرع NP في العظم تحت الغضروف نموذجًا للحيوانًا من MC.
التغييرات المعدلة (MC) هي آفات من الطرف الفقري ونخاع العظم المجاور المرئي على التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). فهي شائعة جدا في الأفراد الذين يعانون من الأعراض المرتبطة 1. أكدت العديد من الدراسات على أهمية MC بسبب ارتباطها بألم أسفل الظهر (LBP) 2،3. وصف De Roos et al.4 و Modic et al.5 بشكل مستقل ثلاثة أنواع مختلفة من تشوهات الإشارة تحت الغضروف في نخاع العظم الفقري. التغييرات المعدلة من النوع الأول هي hypointense على تسلسل T1 الموزونة (T1W) وفرط الشد على تسلسل T2 المرجح (T2W). تكشف هذه الآفة عن ألواح نهاية الشق وأنسجة الحبيبات الوعائية المجاورة في نخاع العظام. تُظهر التغييرات المعدلة من النوع الثاني إشارة عالية على كل من تسلسل T1W و T2W. في هذا النوع من الآفة ، يمكن العثور على تدمير اللوحات النهائية ، وكذلك استبدال الدهون النسيجية لنخاع العظم المجاور. تُظهر التغييرات المعدلة من النوع الثالث إشارة منخفضة في تسلسل T1W و T2W. وقد لوحظت آفات الصلبة المقابلة للصفوف النهائية 6. يعتبر MC مرضًا مرضيًا للعمود الفقري ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بالعديد من الأمراض التنكسية في العمود الفقري 7،8،9.
بالنظر إلى البيانات المتاحة ، قدمت العديد من الدراسات رؤى مفصلة حول مسببات الآليات والمرضية لـ MC. ألبرت وآخرون. اقترح أن MC قد يكون ناتج عن فتق القرص 8. هو وآخرون. نسبت MC إلى تنكس القرص الشديد 10. اقترح Kroc مفهوم "تمزق القرص الداخلي" ، والذي ينص على أن صدمة القرص المتكررة قد تؤدي إلى microtears في الطبق. بعد تشكيل الشق ، قد يؤدي تدمير اللوحات النهائية من قبل اللب النووي (NP) إلى استجابة المناعة الذاتية ، مما يؤدي إلى تطوير MC11. ما وآخرون. شاركت وجهة نظر مماثلة وذكرت أن المناعة الذاتية الناجمة عن NP تلعب دورًا رئيسيًا في التسبب في MC12.
تلعب خلايا الجهاز المناعي ، وخاصة الخلايا اللمفاوية المساعد CD4+ T ، دورًا مهمًا في التسبب في المناعة الذاتية 13. تنتج المجموعة الفرعية Th17 المكتشفة مؤخرًا السيتوكينات الالتهابية IL-17 ، وتعزز تعبير Chemokine ، وتحفز الخلايا التائية في الأعضاء التالفة لإنتاج IFN-γ14. تلعب خلايا Th2 أيضًا دورًا فريدًا في التسبب في الاستجابات المناعية. يمكن أن يؤدي التعبير عن IL-4 كخلية تمثيلية Th2 إلى عواقب المناعة الحادة 15.
على الرغم من أن العديد من الدراسات السريرية قد أجريت على MC16،17،18،19،20،21،22،23،24 ، لا يزال هناك نقص في نماذج تجريبية مناسبة للحيوانات يمكن أن تحاكي عملية MC التي تحدث بشكل متكرر في البشر ويمكن أن تكون تستخدم للتحقيق في المسببات أو العلاجات الجديدة مثل العلاج المستهدف. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن عدد قليل من النماذج الحيوانية من MC لدراسة الآليات المرضية الأساسية.
استنادًا إلى نظرية المناعة الذاتية التي اقترحها ألبرت و MA ، أنشأت هذه الدراسة نموذجًا بسيطًا وقابلًا للاستنساخ MC عن طريق زرع NP التلقائي بالقرب من لوحة النهاية الفقرية المحفورة. تتمثل الأهداف الأخرى في مراقبة الخصائص النسيجية للنماذج الحيوانية وتقييم الآليات المحددة لـ NP في تطوير MC. تحقيقًا لهذه الغاية ، نستخدم تقنيات مثل البيولوجيا الجزيئية والتصوير بالرنين المغناطيسي والدراسات النسيجية لدراسة تطور MC.
توفي اثنان من الأرانب من نزيف أثناء الجراحة ، وتوفي أربعة أرانب أثناء التخدير خلال التصوير بالرنين المغناطيسي. نجا 48 الأرانب المتبقية ولم تظهر أي علامات سلوكية أو عصبية بعد الجراحة.
يوضح التصوير بالرنين المغناطيسي أن شدة إشارة الأنسجة المضمنة في ثقوب مختلفة مختلفة. تغيرت شدة الإشارة للجسم الفقري L5 في مجموعة NPE تدريجياً في 12 و 16 و 20 أسبوعًا بعد الإدراج (أظهر تسلسل T1W إشارة منخفضة ، وأظهر تسلسل T2W إشارة مختلطة بالإضافة إلى إشارة منخفضة) (الشكل 1C) ، في حين أن مظاهر التصوير بالرنين المغناطيسي من بين المجموعتين الأخريين من الأجزاء المدمجة ظلت مستقرة نسبيا خلال نفس الفترة (الشكل 1A ، ب).
(أ) التصوير بالرنين المغناطيسي التمثيلي للعمود الفقري القطني الأرنب في 3 نقاط زمنية. لم يتم العثور على تشوهات الإشارة في صور مجموعة عملية الشام. (ب) تتشابه خصائص إشارة الجسم الفقري في مجموعة ME مع تلك الموجودة في مجموعة عملية التوظيف ، ولا يلاحظ أي تغيير كبير في الإشارة في موقع التضمين مع مرور الوقت. (ج) في مجموعة NPE ، تكون الإشارة المنخفضة مرئية بوضوح في تسلسل T1W ، والإشارة المختلطة والإشارة المنخفضة مرئية بشكل واضح في تسلسل T2W. من فترة 12 أسبوعًا إلى فترة 20 أسبوعًا ، فإن الإشارات العالية المتقطعة المحيطة بالإشارات المنخفضة في انخفاض تسلسل T2W.
يمكن رؤية تضخم العظام الواضح في موقع الزرع للجسم الفقري في مجموعة NPE ، ويحدث تضخم العظام أسرع من 12 إلى 20 أسبوعًا (الشكل 2C) مقارنةً بمجموعة NPE ، ولم يلاحظ أي تغيير كبير في الفقرة المصممة على غرار الهيئات مجموعة شام ومجموعة ME (الشكل 2C) 2A ، ب).
(أ) سطح الجسم الفقري في الجزء المزروع ناعم للغاية ، والثقب يشفي جيدًا ، ولا يوجد تضخم في الجسم الفقري. (ب) يشبه شكل الموقع المزروع في مجموعة ME في مجموعة العمليات الوهمية ، ولا يوجد تغيير واضح في ظهور الموقع المزروع مع مرور الوقت. (ج) حدث تضخم العظام في الموقع المزروع في مجموعة NPE. زاد تضخم العظام بسرعة وحتى امتدت من خلال القرص الفقري إلى الجسم الفقري المقابل.
يوفر التحليل النسيجي معلومات أكثر تفصيلاً حول تكوين العظام. يوضح الشكل 3 صور أقسام ما بعد الجراحة ملطخة بـ H&E. في مجموعة الشحوم ، تم ترتيب الخلايا الغضروفية بشكل جيد ولم يتم اكتشاف أي تكاثر للخلايا (الشكل 3A). كان الوضع في مجموعة ME مشابهًا لتلك الموجودة في مجموعة الشحوم (الشكل 3 ب). ومع ذلك ، في مجموعة NPE ، لوحظ عدد كبير من الخلايا الغضروفية وانتشار الخلايا التي تشبه NP في موقع الزرع (الشكل 3C) ؛
(أ) يمكن رؤية trabeculae بالقرب من اللوحة النهائية ، يتم ترتيب الخلايا الغضروفية بدقة مع حجم الخلايا الموحدة والشكل وليس تكاثر (40 مرة). (ب) حالة موقع الزرع في مجموعة ME تشبه حالة المجموعة الوهمية. يمكن رؤية trabeculae و chondrocytes ، ولكن لا يوجد انتشار واضح في موقع الزرع (40 مرة). (ب) يمكن أن نرى أن الخلايا الغضروفية والخلايا الشبيهة NP تتكاثر بشكل كبير ، وأن شكل وحجم الخلايا الغضروفية غير متساوية (40 مرة).
وقد لوحظ التعبير عن interleukin 4 (IL-4) mRNA ، interleukin 17 (IL-17) mRNA ، والإنترفيرون γ (IFN-γ) mRNA في كل من مجموعات NPE و ME. عندما تمت مقارنة مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة ، تم زيادة تعبيرات الجينات لـ IL-4 و IL-17 و IFN-γ بشكل كبير في مجموعة NPE مقارنة مع تعبيرات مجموعة ME ومجموعة التشغيل الوهمي (الشكل 4) (P <0.05). بالمقارنة مع مجموعة العمليات الوهمية ، زادت مستويات التعبير عن IL-4 و IL-17 و IFN-γ في مجموعة ME قليلاً فقط ولم تصل إلى تغيير إحصائي (P> 0.05).
أظهر تعبير مرنا من IL-4 و IL-17 و IFN-γ في مجموعة NPE اتجاهًا أعلى بكثير من تلك الموجودة في مجموعة العمليات الوهمية ومجموعة ME (P <0.05).
في المقابل ، لم تظهر مستويات التعبير في مجموعة ME أي فرق كبير (P> 0.05).
تم إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ضد IL-4 و IL-17 لتأكيد نمط التعبير mRNA المتغير. كما هو مبين في الأشكال 5A ، B ، مقارنة مع مجموعة ME ومجموعة التشغيل الوهمي ، زادت مستويات البروتين من IL-4 و IL-17 في مجموعة NPE بشكل كبير (P <0.05). بالمقارنة مع مجموعة التشغيل الوهمية ، فشلت مستويات البروتين في IL-4 و IL-17 في مجموعة ME أيضًا في الوصول إلى تغييرات ذات دلالة إحصائية (P> 0.05).
(أ) كانت مستويات البروتين من IL-4 و IL-17 في مجموعة NPE أعلى بكثير من تلك الموجودة في مجموعة ME ومجموعة الدواء الوهمي (P <0.05). (ب) الرسم البياني لطخة غربية.
بسبب العدد المحدود من العينات البشرية التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة ، تكون الدراسات الواضحة والمفصلة حول التسبب في MC صعبة إلى حد ما. حاولنا إنشاء نموذج حيواني لـ MC لدراسة آلياتها المرضية المحتملة. في الوقت نفسه ، تم استخدام التقييم الإشعاعي والتقييم النسيجي والتقييم البيولوجي الجزيئي لمتابعة مجرى MC الناجم عن NP Autograft. ونتيجة لذلك ، أدى نموذج زرع NP إلى تغيير تدريجي في شدة الإشارة من 12 أسبوعًا إلى 20 أسبوعًا (إشارة منخفضة مختلطة في تسلسل T1W والإشارة المنخفضة في تسلسل T2W) ، مما يشير إلى تغييرات الأنسجة ، والتغيرات النسيجية والجزيئية أكدت التقييمات البيولوجية نتائج الدراسة الإشعاعية.
تظهر نتائج هذه التجربة أن التغييرات البصرية والنسيجية حدثت في موقع انتهاك الجسم الفقري في مجموعة NPE. في الوقت نفسه ، لوحظ التعبير عن جينات IL-4 و IL-17 و IFN-γ ، وكذلك IL-4 و IL-17 و IFN-γ ، مما يشير إلى أن انتهاك أنسجة اللب النووية الذاتية في الفقر قد يسبب الجسم سلسلة من الإشارة والتغيرات المورفولوجية. من السهل أن نجد أن خصائص الإشارة للأجسام الفقرية للنموذج الحيوانية (إشارة منخفضة في تسلسل T1W ، والإشارة المختلطة والإشارة المنخفضة في تسلسل T2W) تشبه إلى حد كبير خصائص الخلايا الفقرية البشرية ، وخصائص التصوير بالرنين المغناطيسي أيضًا تأكد من ملاحظات الأنسجة والتشريح الإجمالي ، أي أن التغييرات في خلايا الجسم الفقرية تقدمية. على الرغم من أن الاستجابة الالتهابية التي تسببها الصدمة الحادة قد تظهر بعد فترة وجيزة من الثقب ، فقد أظهرت نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي أن زيادة الإشارة بشكل تدريجي ظهرت بعد 12 أسبوعًا من الثقب واستمرت لمدة تصل إلى 20 أسبوعًا دون أي علامات على الانتعاش أو عكس تغييرات التصوير بالرنين المغناطيسي. هذه النتائج تشير إلى أن NP الفقري الذاتي هو وسيلة موثوقة لإنشاء MV التدريجي في الأرانب.
يتطلب نموذج الثقب هذا مهارة ووقت وجهد جراحي مناسب. في التجارب الأولية ، قد يؤدي تشريح أو التحفيز المفرط للهياكل الرباطية المفرطة إلى تكوين عظمية الفقرات. يجب توخي الحذر حتى لا تتلف أو تهيج الأقراص المجاورة. نظرًا لأنه يجب التحكم في عمق الاختراق للحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار ، فقد صنعنا توصيلًا يدويًا عن طريق قطع غمد إبرة طويلة 3 مم. يضمن استخدام هذا المكونات عمق الحفر الموحد في الجسم الفقري. في التجارب الأولية ، وجد ثلاثة جراحين لجراحة تقويم العظام المشاركين في العملية إبر قياس 16 سهلاً في العمل مع إبر قياس أكثر من 18 أو طرق أخرى. لتجنب النزيف المفرط أثناء الحفر ، سيوفر الاحتفاظ بالإبرة لفترة من الوقت حفرة إدخال أكثر ملاءمة ، مما يشير إلى أنه يمكن التحكم في درجة معينة من MC بهذه الطريقة.
على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استهدفت MC ، إلا أنه لا يُعرف سوى القليل عن مسببات التسبب في MC25،26،27. بناءً على دراساتنا السابقة ، وجدنا أن المناعة الذاتية تلعب دورًا رئيسيًا في حدوث وتطوير MC12. درست هذه الدراسة التعبير الكمي لـ IL-4 و IL-17 و IFN-γ ، والتي هي مسارات التمايز الرئيسية لخلايا CD4+ بعد تحفيز المستضد. في دراستنا ، بالمقارنة مع المجموعة السلبية ، كان لمجموعة NPE تعبير أعلى عن IL-4 و IL-17 و IFN-γ ، وكانت مستويات البروتين من IL-4 و IL-17 أعلى أيضًا.
سريريا ، يتم زيادة تعبير IL-17 مرنا في خلايا NP من المرضى الذين يعانون من فتق القرص 28. تم العثور على زيادة مستويات التعبير IL-4 و IFN-γ أيضًا في نموذج فتق القرص غير الضوئي الحاد مقارنةً بعناصر تحكم صحية 29. يلعب IL-17 دورًا رئيسيًا في الالتهاب ، وإصابة الأنسجة في أمراض المناعة الذاتية 30 ويعزز الاستجابة المناعية لـ IFN-31. تم الإبلاغ عن إصابة الأنسجة بوساطة IL-17 في الفئران MRL/LPR والفئران المناعي الذاتي. يمكن أن يمنع IL-4 التعبير عن السيتوكينات المسببة للالتهابات (مثل IL-1β و TNFα) وتفعيل البلاعم 34. أفيد أن تعبير مرنا من IL-4 كان مختلفًا في مجموعة NPE مقارنةً بـ IL-17 و IFN-γ في نفس الوقت ؛ كان تعبير مرنا من IFN-γ في مجموعة NPE أعلى بكثير من ذلك في المجموعات الأخرى. لذلك ، قد يكون إنتاج IFN-γ وسيطًا للاستجابة الالتهابية الناجم عن NP intercalation. وقد أظهرت الدراسات أن IFN-γ تنتج بواسطة أنواع خلايا متعددة ، بما في ذلك الخلايا T من النوع 1 المنشط ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والبلاعم 35،36 ، وهي عبارة عن سيتوكين رئيسي مؤيد للالتهابات يعزز الاستجابات المناعية 37.
تشير هذه الدراسة إلى أن استجابة المناعة الذاتية قد تشارك في حدوث وتطور MC. لوما وآخرون. وجدت أن خصائص إشارة MC و NP البارزة متشابهة في التصوير بالرنين المغناطيسي ، وكلاهما يظهر إشارة عالية في تسلسل T2W38. تم تأكيد بعض السيتوكينات المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بحدوث MC ، مثل IL-139. ما وآخرون. اقترح أن النتوء الصعودي أو النزول من NP قد يكون له تأثير كبير على حدوث وتطوير MC12. أفاد Bobechko40 و Herzbein et al.41 أن NP هو أنسجة مناعية لا يمكنها دخول الدورة الدموية من الولادة. تقدم نتوءات NP أجسامًا أجنبية في إمدادات الدم ، وبالتالي التوسط في تفاعلات المناعة الذاتية المحلية 42. يمكن أن تحفز تفاعلات المناعة الذاتية عددًا كبيرًا من العوامل المناعية ، وعندما تتعرض هذه العوامل بشكل مستمر للأنسجة ، يمكن أن تسبب تغييرات في الإشارة 43. في هذه الدراسة ، يعد الإفراط في التعبير عن IL-4 و IL-17 و IFN-γ عوامل مناعية نموذجية ، مما يثبت العلاقة الوثيقة بين NP و MCS44. يحاكي هذا النموذج الحيواني جيدًا إن اختراق NP والدخول إلى اللوحة النهائية. كشفت هذه العملية كذلك عن تأثير المناعة الذاتية على MC.
كما هو متوقع ، يوفر لنا هذا النموذج الحيواني منصة محتملة لدراسة MC. ومع ذلك ، لا يزال هذا النموذج لديه بعض القيود: أولاً ، خلال مرحلة مراقبة الحيوانات ، تحتاج بعض الأرانب المرحلة المتوسطة إلى التخلص من الاختبارات النسيجية والجزيئية ، لذلك بعض الحيوانات "تسقط عن الاستخدام" مع مرور الوقت. ثانياً ، على الرغم من أن ثلاث نقاط زمنية تم تحديدها في هذه الدراسة ، للأسف ، قمنا فقط بتصميم نوع واحد من MC (النوع المعدلي الذي أغيره) ، لذلك لا يكفي تمثيل عملية تطوير الأمراض البشرية ، ويجب ضبط المزيد راقب بشكل أفضل كل تغييرات الإشارات. ثالثًا ، يمكن بالفعل أن تظهر التغييرات في بنية الأنسجة بوضوح عن طريق تلطيخ النسيجية ، ولكن يمكن أن تكشف بعض التقنيات المتخصصة عن التغيرات المجهرية في هذا النموذج بشكل أفضل. على سبيل المثال ، تم استخدام المجهر للضوء المستقطب لتحليل تكوين الفيبروكارتيلاج في الأقراص الفقرية الفقرية 45. تتطلب الآثار الطويلة الأجل لـ NP على MC واللوحة النهائية مزيدًا من الدراسة.
تم تقسيم أربعة وخمسين من أرانب نيوزيلندا البيضاء (الوزن حوالي 2.5-3 كيلوغرام ، 3-3.5 أشهر) بشكل عشوائي إلى مجموعة العمليات الوهمية ، مجموعة زرع العضلات (مجموعة ME) ومجموعة زرع جذر الأعصاب (مجموعة NPE). تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تيانجين ، وتم تنفيذ الأساليب التجريبية بما يتوافق بشكل صارم للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
تم إجراء بعض التحسينات على التقنية الجراحية لـ S. Sobajima 46. تم وضع كل أرنب في موضع إعادة تدوير جانبي وتم تعرض السطح الأمامي لخمس أقراص متتالية من الفقري القطني (IVDs) باستخدام نهج خلف الصفاق الخلفي. أعطى كل أرنب تخدير عام (20 ٪ يوريتان ، 5 مل/كغ عبر الوريد الأذن). تم تصنيع شق الجلد الطولي من الحافة السفلية للأضلاع إلى حافة الحوض ، بطني 2 سم إلى عضلات paravertebral. تعرض العمود الفقري الأمامي الأيمن من L1 إلى L6 عن طريق تشريح حاد وصريح للأنسجة تحت الجلد المغطاة ، والأنسجة خلف الصفاق ، والعضلات (الشكل 6 أ). تم تحديد مستوى القرص باستخدام حافة الحوض كمعلم تشريحي لمستوى القرص L5-L6. استخدم إبرة ثقب المقياس 16 لحفر ثقب بالقرب من اللوحة النهائية لفقرة L5 إلى عمق 3 مم (الشكل 6 ب). استخدم محقنة 5 مل لتخلق اللب النووي الذاتي في القرص الفقري L1-L2 (الشكل 6C). قم بإزالة اللب النووي أو العضلات وفقًا لمتطلبات كل مجموعة. بعد تعميق ثقب الحفر ، يتم وضع خيوط قابلة للامتصاص على اللفافة العميقة والفلفات السطحية والجلد ، مع الحرص على عدم تلف الأنسجة السمحافية للجسم الفقري أثناء الجراحة.
(أ) يتعرض قرص L5 - L6 من خلال نهج خلف الصفاق الخلفي. (ب) استخدم إبرة قياس 16 لحفر ثقب بالقرب من لوحة نهاية L5. (ج) يتم حصاد MFs ذاتي.
كانت تدار التخدير العام مع 20 ٪ يوريتان (5 مل/كجم) التي تدار عن طريق الوريد الأذن ، وتكرار الأشعة العمود الفقري القطني في 12 و 16 و 20 أسبوعا بعد العمل الجراحي.
تم التضحية بالأرانب عن طريق الحقن العضلي للكيتامين (25.0 ملغ/كغ) وسمات الصوديوم في الوريد (1.2 جم/كجم) في 12 و 16 و 20 أسبوعًا بعد الجراحة. تمت إزالة العمود الفقري بأكمله للتحليل النسيجي وتم إجراء تحليل حقيقي. تم استخدام النسخ العكسي الكمي (RT-QPCR) والنشاف الغربي للكشف عن التغيرات في العوامل المناعية.
تم إجراء فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي في الأرانب باستخدام مغناطيس إكلينيكي سعة 3.0 تي (GE Medical Systems ، Florence ، SC) مجهز بمستقبل لفائف الطرف المتعامد. تم تخدير الأرانب مع يوريتان بنسبة 20 ٪ (5 مل/كغ) عبر الوريد الأذن ثم وضعت غلافًا داخل المغناطيس مع المنطقة القطنية المتمركزة على ملف سطح دائري قطره 5 بوصات (الأنظمة الطبية GE). تم الحصول على صور المترجم التاجية T2 (TR ، 1445 مللي ثانية ؛ TE ، 37 مللي ثانية) لتحديد موقع القرص القطني من L3-L4 إلى L5-L6. تم الحصول على شرائح طائرة Sagittal T2 المرجح مع الإعدادات التالية: تسلسل سريع للدوران مع وقت تكرار (TR) من 2200 مللي ثانية ووقت صدى (TE) من 70 مللي ثانية ، مصفوفة ؛ المجال البصري من 260 وثمانية محفزات ؛ كان سمك القطع 2 مم ، وكانت الفجوة 0.2 مم.
بعد التقاط الصورة الأخيرة وقتل الأرنب الأخير ، تمت إزالة أقراص الخزانة ، المدمجة في العضلات ، وإزالة NP للفحص النسيجي. تم إصلاح الأنسجة في فورمالين محايدة 10 ٪ لمدة أسبوع واحد ، مُعدّل بحمض الإيثيلينديامينيتريتيك ، ومقطوع البارافين. تم تضمين كتل الأنسجة في البارافين وقطعت إلى أقسام سهمي (5 ميكرون سميكة) باستخدام microtome. كانت مقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E).
بعد جمع الأقراص الفقرية من الأرانب في كل مجموعة ، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام عمود UNIQ-10 (شركة Shanghai Sangon Biotechnology Co. ، Ltd. ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ونظام النسخ العكسي العكسي (PROMEGA Inc. ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء النسخ العكسي.
تم إجراء RT-QPCR باستخدام Prism 7300 (Applied Biosystems Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية) و Sybr Green Jump Start Taq Taq (Sigma-Aldrich ، St. Louis ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كان حجم تفاعل PCR 20 ميكرولتر وكان يحتوي على 1.5 ميكرولتر من [كدنا] المخفف و 0.2 ميكرون من كل تمهيدي. تم تصميم الاشعال من قبل Oligoperfect Designer (Invitrogen ، Valencia ، CA) وتم تصنيعه بواسطة Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co. ، Ltd. (الصين) (الجدول 1). تم استخدام ظروف ركوب الدراجات الحرارية التالية: خطوة تنشيط البوليميريز الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، ثم 40 دورة من 15 ثانية كل 94 درجة مئوية لإخماد القالب ، والصلصة لمدة 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، والتمديد ، والفلور. وأجريت القياسات لمدة 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية. تم تضخيم جميع العينات ثلاث مرات واستخدم متوسط ​​القيمة لتحليل RT-QPCR. تم تحليل بيانات التضخيم باستخدام FlexStation 3 (الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيع IL-4 ، IL-17 ، و IFN-γ التعبير الجيني إلى التحكم الداخلي (ACTB). تم حساب مستويات التعبير النسبية من مرنا المستهدف باستخدام طريقة 2-ΔTC.
تم استخراج البروتين الكلي من الأنسجة باستخدام متجانس الأنسجة في المخزن المؤقت تحلل RIPA (يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز) ثم الطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الأنسجة. تم تحميل خمسين ميكروغرام من البروتين لكل حارة ، مفصولة بنسبة 10 ٪ SDS-PAGE ، ثم نقلها إلى غشاء PVDF. تم إجراء الحظر في الحليب الجاف 5 ٪ غير الدهني في ملحي تريس (TBS) الذي يحتوي على 0.1 ٪ Tween 20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تحضين الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية المضادة للديكورين (مخفف 1: 200 ؛ بوستر ، ووهان ، الصين) (مخفف 1: 200 ؛ Bioss ، بكين ، الصين) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية وردع في الأيام الثانية ؛ مع الأجسام المضادة الثانوية (غلوبولين المناعي المضاد للأرنب G في 1: 40،000 التخفيف) جنبا إلى جنب مع بيروكسيداز الفجل (Boster ، ووهان ، الصين) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن إشارات لطخة غربية عن طريق زيادة التألق الكيميائي على الغشاء الكيميائي بعد تشعيع الأشعة السينية. لتحليل الكثافة ، تم مسح البقع وقياسها باستخدام برامج النطاق النطاق وتم التعبير عن النتائج كنسبة من مناعة الجينات المستهدفة إلى المناعة التوبولين.
تم إجراء الحسابات الإحصائية باستخدام حزمة برامج SPSS16.0 (SPSS ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعبير عن البيانات التي تم جمعها أثناء الدراسة على أنها الانحراف المعياري (متوسط ​​± SD) وتحليله باستخدام تحليل التدابير المتكررة أحادية الاتجاه (ANOVA) لتحديد الاختلافات بين المجموعتين. اعتبر P <0.05 ذات دلالة إحصائية.
وبالتالي ، فإن إنشاء نموذج حيواني لـ MC عن طريق زرع NPs ذاتي في الجسم الفقري وأداء الملاحظة الكلية ، وتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي ، والتقييم النسيجي ، والتحليل البيولوجي الجزيئي ، قد يصبح أداة مهمة لتقييم وفهم آليات MC البشرية وتطوير علاجية جديدة جديدة التدخلات.
كيفية الاستشهاد بهذه المقالة: هان ، سي. وآخرون. تم إنشاء نموذج حيواني للتغيرات المعدلة عن طريق زرع لب النواة الذاتي في العظم تحت الغضروف للعمود الفقري القطني. SCI. Rep. 6 ، 35102: 10.1038/SREP35102 (2016).
Weishaupt ، D. ، Zanetti ، M. ، Hodler ، J. ، and Boos ، N. التصوير بالرنين المغناطيسي للعمود الفقري القطني: انتشار فتق القرص والاحتفاظ به ، ضغط جذر الأعصاب ، تشوهات اللوحة النهائية ، والتهاب المفاصل المفصل في الوجه في المتطوعين غير المتطوعين غير الأعراض. . معدل. الأشعة 209 ، 661–666 ، doi: 10.1148/الأشعة .209.3.9844656 (1998).
Kjaer ، P. ، Korsholm ، L. ، Bendix ، T. ، Sorensen ، JS ، و Leboeuf-Eed ، K. مجلة العمود الفقري الأوروبي: النشر الرسمي لجمعية العمود الفقري الأوروبي ، والجمعية الأوروبية للتشوه الشوكي ، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري عنق الرحم 15 ، 1312-1319 ، DOI: 10.1007/S00586-006-0185-X (2006).
Kuisma ، M. ، et al. التغييرات المعدلة في الطرف الفقري القطني: الانتشار والارتباط بألم أسفل الظهر وعرق النسا في العمال الذكور في منتصف العمر. العمود الفقري 32 ، 1116-1122 ، doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos ، A. ، Kressel ، H. ، Spritzer ، K. ، and Dalinka ، M. MRI من نخاع العظم يتغير بالقرب من لوحة النهاية في مرض العمود الفقري القطني. AJR. المجلة الأمريكية للأشعة 149 ، 531-534 ، دوي: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic ، MT ، Steinberg ، PM ، Ross ، JS ، Masaryk ، TJ ، and Carter ، JR Discist Discise: تقييم تغييرات النخاع الفقري مع التصوير بالرنين المغناطيسي. الأشعة 166 ، 193-199 ، doi: 10.1148/الأشعة .166.1.3336678 (1988).
Modic ، MT ، Masaryk ، TJ ، Ross ، JS ، and Carter ، JR Imaging لمرض القرص التنكسي. الأشعة 168 ، 177-186 ، doi: 10.1148/الأشعة .168.1.3289089 (1988).
Jensen ، TS ، وآخرون. تنبؤات تغييرات الإشارات النهائية (MODIC) النيوفيريبرال في عموم السكان. مجلة العمود الفقري الأوروبي: النشر الرسمي لجمعية العمود الفقري الأوروبي ، والجمعية الأوروبية للتشوه الشوكي ، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري عنق الرحم ، القسم 19 ، 129-135 ، دوي: 10.1007/S00586-009-1184-5 (2010).
ألبرت ، HB و Mannisch ، K. تغييرات Modic بعد فتق القرص القطني. مجلة العمود الفقري الأوروبي: النشر الرسمي لجمعية العمود الفقري الأوروبي ، الجمعية الأوروبية للتشوه الشوكي والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري عنق الرحم 16 ، 977-982 ، DOI: 10.1007/S00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula ، L. ، Luoma ، K. ، Vehmas ، T. ، Gronblad ، M. ، and Kaapa ، E. يمكن أن تتنبأ تغييرات النوع الأول من النوع الأول من تنكس القرص التشويري التدريجي السريع: دراسة مستقبلية لمدة عام. مجلة العمود الفقري الأوروبي 21 ، 1135-1142 ، doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu ، ZJ ، Zhao ، FD ، Fang ، XQ و Fan ، تغييرات معدنية SW: الأسباب المحتملة والمساهمة في تنكس القرص القطني. الفرضيات الطبية 73 ، 930-932 ، doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
KROK ، HV DISC DISSPURE. مشاكل هبوط القرص أكثر من 50 عامًا. العمود الفقري (Phila PA 1976) 11 ، 650–653 (1986).