زرع النواة اللبية الذاتية في العظم تحت الغضروفي القطني لإنشاء نموذج حيواني لتغيرات موديك

نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام متصفح أحدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
يُعدّ إنشاء نماذج حيوانية لتغيرات موديك (MC) أساسًا هامًا لدراسة هذه التغيرات. قُسِّمت أربعة وخمسون أرنبًا أبيض من سلالة نيوزيلندا إلى ثلاث مجموعات: مجموعة العمليات الوهمية، ومجموعة زرع العضلات (مجموعة ME)، ومجموعة زرع النواة اللبية (مجموعة NPE). في مجموعة NPE، تم كشف القرص الفقري القطني من خلال مدخل جراحي أمامي جانبي، واستُخدمت إبرة لثقب جسم الفقرة القطنية الخامسة (L5) بالقرب من الصفيحة النهائية. استُخرجت النواة اللبية من القرص الفقري القطني الأول/الثاني (L1/2) باستخدام محقنة، ثم حُقنت فيه. بعد ذلك، حُفر ثقب في العظم تحت الغضروفي. كانت الإجراءات الجراحية وطرق الحفر في مجموعة زرع العضلات ومجموعة العمليات الوهمية مماثلة لتلك المُستخدمة في مجموعة زرع النواة اللبية. في مجموعة ME، وُضعت قطعة من العضلة في الثقب، بينما لم يُوضع أي شيء في الثقب في مجموعة العمليات الوهمية. بعد العملية، أُجري فحص بالرنين المغناطيسي واختبارات بيولوجية جزيئية. تغيرت الإشارة في مجموعة NPE، بينما لم يطرأ أي تغيير ملحوظ في الإشارة في مجموعة الجراحة الوهمية ومجموعة ME. أظهر الفحص النسيجي وجود تكاثر غير طبيعي للأنسجة في موضع الزرع، وزيادة في التعبير عن IL-4 وIL-17 وIFN-γ في مجموعة NPE. يمكن لزرع NP في العظم تحت الغضروفي أن يُشكل نموذجًا حيوانيًا لمرض MC.
تُعدّ تغيرات موديك (MC) آفاتٍ تصيب الصفائح النهائية للفقرات ونخاع العظم المجاور، وتظهر في التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وهي شائعةٌ نسبيًا لدى الأفراد الذين يعانون من أعراضٍ مصاحبة.¹ وقد أكدت العديد من الدراسات على أهمية تغيرات موديك لارتباطها بألم أسفل الظهر.^2،3 وقد وصف كلٌ من دي روس وآخرون⁴ وموديك وآخرون⁵، بشكلٍ مستقل، ثلاثة أنواعٍ مختلفة من شذوذ الإشارة تحت الغضروفية في نخاع عظم الفقرات. تظهر تغيرات موديك من النوع الأول منخفضة الإشارة في تسلسلات T1 الموزونة (T1W) وعالية الإشارة في تسلسلات T2 الموزونة (T2W). وتُظهر هذه الآفة شقوقًا في الصفائح النهائية ونسيجًا حبيبيًا وعائيًا مجاورًا في نخاع العظم. أما تغيرات موديك من النوع الثاني فتُظهر إشارةً عالية في كلٍ من تسلسلات T1W وT2W. وفي هذا النوع من الآفات، يمكن ملاحظة تدمير الصفائح النهائية، بالإضافة إلى استبدال نخاع العظم المجاور بنسيجٍ دهني. بينما تُظهر تغيرات موديك من النوع الثالث إشارةً منخفضة في تسلسلات T1W وT2W. لوحظت آفات تصلبية تتوافق مع الصفائح النهائية6. يعتبر MC مرضًا مرضيًا في العمود الفقري ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بالعديد من الأمراض التنكسية في العمود الفقري7،8،9.
بالنظر إلى البيانات المتاحة، قدمت العديد من الدراسات رؤى تفصيلية حول أسباب وآليات مرض MC. اقترح ألبرت وآخرون أن MC قد يكون ناتجًا عن انزلاق غضروفي⁸. ونسب هو وآخرون MC إلى تنكس غضروفي حاد¹⁰. واقترح كروك مفهوم "التمزق الداخلي للغضروف"، والذي ينص على أن الصدمات المتكررة للغضروف قد تؤدي إلى تمزقات دقيقة في الصفيحة النهائية. بعد تشكل الشق، قد يؤدي تدمير الصفيحة النهائية بواسطة النواة اللبية (NP) إلى استجابة مناعية ذاتية، مما يؤدي بدوره إلى تطور MC¹¹. وشارك ما وآخرون وجهة نظر مماثلة، وأفادوا بأن المناعة الذاتية الناجمة عن النواة اللبية تلعب دورًا رئيسيًا في نشأة MC¹².
تلعب خلايا الجهاز المناعي، وخاصة الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة CD4+، دورًا حاسمًا في إمراضية أمراض المناعة الذاتية¹³. وتنتج المجموعة الفرعية Th17 المكتشفة حديثًا السيتوكين الالتهابي IL-17، وتعزز التعبير عن الكيموكينات، وتحفز الخلايا التائية في الأعضاء المتضررة على إنتاج IFN-γ¹⁴. كما تلعب خلايا Th2 دورًا فريدًا في إمراضية الاستجابات المناعية. ويمكن أن يؤدي التعبير عن IL-4، باعتباره مؤشرًا على خلايا Th2، إلى عواقب مناعية مرضية وخيمة¹⁵.
على الرغم من إجراء العديد من الدراسات السريرية على MC16،17،18،19،20،21،22،23،24، لا يزال هناك نقص في النماذج الحيوانية التجريبية المناسبة التي تحاكي عملية MC الشائعة لدى البشر، والتي يمكن استخدامها لدراسة أسباب المرض أو العلاجات الجديدة، مثل العلاج الموجه. وحتى الآن، لم يُنشر سوى عدد قليل من النماذج الحيوانية لـ MC لدراسة الآليات المرضية الكامنة وراءه.
استنادًا إلى نظرية المناعة الذاتية التي اقترحها ألبرت وما، أنشأت هذه الدراسة نموذجًا بسيطًا وقابلًا للتكرار لسرطان الخلايا الحرشفية في الأرانب عن طريق زرع النواة اللبية ذاتيًا بالقرب من الصفيحة الفقرية النهائية المثقوبة. وتشمل الأهداف الأخرى رصد الخصائص النسيجية للنماذج الحيوانية وتقييم الآليات المحددة للنواة اللبية في تطور سرطان الخلايا الحرشفية. ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا تقنيات مثل البيولوجيا الجزيئية والتصوير بالرنين المغناطيسي والدراسات النسيجية لدراسة تطور سرطان الخلايا الحرشفية.
نفق أرنبان بسبب النزيف أثناء الجراحة، ونفق أربعة أرانب أثناء التخدير خلال التصوير بالرنين المغناطيسي. أما الأرانب الـ 48 المتبقية فقد نجت ولم تظهر عليها أي علامات سلوكية أو عصبية بعد الجراحة.
يُظهر التصوير بالرنين المغناطيسي أن شدة الإشارة للأنسجة المزروعة في الثقوب المختلفة تختلف. تغيرت شدة الإشارة لجسم الفقرة القطنية الخامسة في مجموعة NPE تدريجيًا عند 12 و16 و20 أسبوعًا بعد الزرع (أظهر تسلسل T1W إشارة منخفضة، وأظهر تسلسل T2W إشارة مختلطة بالإضافة إلى إشارة منخفضة) (الشكل 1C)، بينما ظلت مظاهر التصوير بالرنين المغناطيسي للمجموعتين الأخريين من الأجزاء المزروعة مستقرة نسبيًا خلال نفس الفترة (الشكل 1A، B).
(أ) صور رنين مغناطيسي متسلسلة نموذجية للعمود الفقري القطني للأرانب في ثلاث نقاط زمنية. لم تُلاحظ أي شذوذات في الإشارة في صور مجموعة العمليات الوهمية. (ب) خصائص إشارة جسم الفقرة في مجموعة ME مشابهة لتلك الموجودة في مجموعة العمليات الوهمية، ولم يُلاحظ أي تغيير ملحوظ في الإشارة في موضع التضمين مع مرور الوقت. (ج) في مجموعة NPE، تظهر الإشارة المنخفضة بوضوح في تسلسل T1W، وتظهر الإشارة المختلطة والإشارة المنخفضة بوضوح في تسلسل T2W. من الأسبوع الثاني عشر إلى الأسبوع العشرين، تتناقص الإشارات العالية المتفرقة المحيطة بالإشارات المنخفضة في تسلسل T2W.
يمكن ملاحظة تضخم العظام الواضح في موقع زرع جسم الفقرة في مجموعة NPE، ويحدث تضخم العظام بشكل أسرع من 12 إلى 20 أسبوعًا (الشكل 2C) مقارنةً بمجموعة NPE، ولم يُلاحظ أي تغيير كبير في أجسام الفقرات المُنمذجة؛ مجموعة Sham ومجموعة ME (الشكل 2C) 2A،B).
(أ) سطح جسم الفقرة في موضع الزرع أملس للغاية، ويلتئم الثقب جيدًا، ولا يوجد تضخم في جسم الفقرة. (ب) شكل موضع الزرع في مجموعة ME مشابه لشكل موضع الزرع في مجموعة العملية الوهمية، ولا يوجد تغيير واضح في مظهر موضع الزرع مع مرور الوقت. (ج) حدث تضخم عظمي في موضع الزرع في مجموعة NPE. ازداد التضخم العظمي بسرعة، بل وامتد عبر القرص الفقري إلى جسم الفقرة المقابلة.
يُقدّم التحليل النسيجي معلومات أكثر تفصيلاً حول تكوين العظام. يُظهر الشكل 3 صورًا للمقاطع بعد الجراحة المصبوغة بصبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين. في مجموعة الجراحة الوهمية، كانت الخلايا الغضروفية مُرتبة بشكل جيد ولم يُرصد أي تكاثر للخلايا (الشكل 3أ). كان الوضع في مجموعة ME مشابهًا لما هو عليه في مجموعة الجراحة الوهمية (الشكل 3ب). مع ذلك، في مجموعة NPE، لوحظ وجود عدد كبير من الخلايا الغضروفية وتكاثر للخلايا الشبيهة بالخلايا اللبية السنخية في موقع الزرع (الشكل 3ج).
(أ) يمكن رؤية العوارض العظمية بالقرب من الصفيحة النهائية، وتكون الخلايا الغضروفية مرتبة بدقة ذات حجم وشكل موحدين، دون تكاثر (تكبير 40 مرة). (ب) حالة موقع الزرع في مجموعة ME مشابهة لحالة مجموعة الشام. يمكن رؤية العوارض العظمية والخلايا الغضروفية، ولكن لا يوجد تكاثر واضح في موقع الزرع (تكبير 40 مرة). (ب) يمكن ملاحظة أن الخلايا الغضروفية والخلايا الشبيهة بالنواة اللبية تتكاثر بشكل ملحوظ، وأن شكل وحجم الخلايا الغضروفية غير متجانسين (تكبير 40 مرة).
لوحظ ارتفاع في مستوى التعبير الجيني للإنترلوكين 4 (IL-4) والإنترلوكين 17 (IL-17) والإنترفيرون غاما (IFN-γ) في كلتا المجموعتين (NPE وME). عند مقارنة مستويات التعبير الجيني للجينات المستهدفة، تبين ارتفاع معنوي في التعبير الجيني لـ IL-4 وIL-17 وIFN-γ في مجموعة NPE مقارنةً بمجموعتي ME والعملية الوهمية (الشكل 4) (P < 0.05). أما في مجموعة ME، فقد ارتفع مستوى التعبير الجيني لـ IL-4 وIL-17 وIFN-γ ارتفاعًا طفيفًا فقط مقارنةً بمجموعة العملية الوهمية، ولم يصل هذا الارتفاع إلى مستوى الدلالة الإحصائية (P > 0.05).
أظهر التعبير عن mRNA لـ IL-4 و IL-17 و IFN-γ في مجموعة NPE اتجاهًا أعلى بشكل ملحوظ من تلك الموجودة في مجموعة العملية الوهمية ومجموعة ME (P < 0.05).
في المقابل، لم تظهر مستويات التعبير في مجموعة ME أي فرق كبير (P>0.05).
أُجري تحليل لطخة ويسترن باستخدام أجسام مضادة متوفرة تجاريًا ضد IL-4 وIL-17 لتأكيد نمط التعبير الجيني المتغير. كما هو موضح في الشكلين 5أ و5ب، مقارنةً بمجموعة ME ومجموعة العملية الوهمية، ارتفعت مستويات بروتين IL-4 وIL-17 في مجموعة NPE بشكل ملحوظ (P < 0.05). في المقابل، لم تصل مستويات بروتين IL-4 وIL-17 في مجموعة ME إلى تغيرات ذات دلالة إحصائية مقارنةً بمجموعة العملية الوهمية (P > 0.05).
(أ) كانت مستويات بروتين IL-4 وIL-17 في مجموعة NPE أعلى بكثير من مستوياتها في مجموعة ME ومجموعة الدواء الوهمي (P < 0.05). (ب) مخطط التوزيع التكراري للتلطيخ الغربي.
نظراً لقلة عدد العينات البشرية التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة، فإن إجراء دراسات واضحة ومفصلة حول آلية حدوث التهاب النخاع الشوكي يُعدّ أمراً صعباً نوعاً ما. لذا، سعينا إلى إنشاء نموذج حيواني لهذا الالتهاب لدراسة آلياته المرضية المحتملة. في الوقت نفسه، استُخدم التقييم الإشعاعي والنسيجي والجزيئي لمتابعة مسار التهاب النخاع الشوكي الناجم عن زرع ذاتي للعصب الشوكي. ونتيجةً لذلك، أظهر نموذج زرع العصب الشوكي تغيراً تدريجياً في شدة الإشارة من الأسبوع الثاني عشر إلى الأسبوع العشرين (إشارة منخفضة مختلطة في تسلسلات T1W وإشارة منخفضة في تسلسلات T2W)، مما يشير إلى تغيرات نسيجية، وقد أكدت التقييمات النسيجية والجزيئية نتائج الدراسة الإشعاعية.
أظهرت نتائج هذه التجربة حدوث تغيرات بصرية ونسيجية في موضع تداخل جسم الفقرة في مجموعة NPE. في الوقت نفسه، لوحظ التعبير عن جينات IL-4 وIL-17 وIFN-γ، بالإضافة إلى مستويات IL-4 وIL-17 وIFN-γ، مما يشير إلى أن تداخل نسيج النواة اللبية الذاتية في جسم الفقرة قد يُسبب سلسلة من التغيرات في الإشارة والشكل. من السهل ملاحظة أن خصائص إشارة أجسام الفقرات في النموذج الحيواني (إشارة منخفضة في تسلسل T1W، وإشارة مختلطة ومنخفضة في تسلسل T2W) تُشابه إلى حد كبير خصائص خلايا الفقرات البشرية، كما تؤكد خصائص التصوير بالرنين المغناطيسي ملاحظات علم الأنسجة والتشريح الإجمالي، أي أن التغيرات في خلايا جسم الفقرة تدريجية. على الرغم من أن الاستجابة الالتهابية الناجمة عن الصدمة الحادة قد تظهر بعد فترة وجيزة من البزل، فقد أظهرت نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي أن تغيرات الإشارة المتزايدة تدريجيًا ظهرت بعد 12 أسبوعًا من البزل واستمرت حتى 20 أسبوعًا دون أي علامات على التعافي أو انعكاس تغيرات التصوير بالرنين المغناطيسي. تشير هذه النتائج إلى أن استخدام النواة اللبية الفقرية الذاتية طريقة موثوقة لإحداث تمزق تدريجي في الفقرات لدى الأرانب.
يتطلب هذا النموذج من الثقب مهارةً كافيةً ووقتًا وجهدًا جراحيًا. في التجارب الأولية، قد يؤدي تشريح أو تحفيز مفرط للأربطة المجاورة للفقرات إلى تكوّن نتوءات عظمية في الفقرات. يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف أو تهيج الأقراص المجاورة. ولأن عمق الاختراق يجب التحكم فيه للحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار، قمنا بصنع سدادة يدويًا عن طريق قطع غلاف إبرة طولها 3 مم. يضمن استخدام هذه السدادة عمق حفر موحد في جسم الفقرة. في التجارب الأولية، وجد ثلاثة جراحين عظام مشاركين في العملية أن الإبر ذات قياس 16 أسهل في الاستخدام من الإبر ذات قياس 18 أو الطرق الأخرى. لتجنب النزيف المفرط أثناء الحفر، فإن تثبيت الإبرة لفترة من الوقت يوفر فتحة إدخال أكثر ملاءمة، مما يشير إلى إمكانية التحكم بدرجة معينة من التباين بهذه الطريقة.
على الرغم من أن العديد من الدراسات قد تناولت مرض الخلايا البدينة، إلا أن المعلومات المتوفرة حول أسبابه وآلياته المرضية لا تزال محدودة. استنادًا إلى دراساتنا السابقة، وجدنا أن المناعة الذاتية تلعب دورًا محوريًا في حدوث وتطور هذا المرض. فحصت هذه الدراسة التعبير الكمي عن الإنترلوكين-4 (IL-4) والإنترلوكين-17 (IL-17) والإنترفيرون غاما (IFN-γ)، وهي المسارات الرئيسية لتكوين خلايا CD4+ بعد تحفيزها بالمستضد. في دراستنا، مقارنةً بالمجموعة الضابطة، أظهرت المجموعة الضابطة (NPE) تعبيرًا أعلى عن IL-4 وIL-17 وIFN-γ، كما كانت مستويات بروتين IL-4 وIL-17 أعلى أيضًا.
سريريًا، يزداد التعبير عن mRNA الخاص بـ IL-17 في خلايا النواة اللبية لدى مرضى انزلاق الغضروف²⁸. كما لوحظ ارتفاع مستويات التعبير عن IL-4 و IFN-γ في نموذج انزلاق الغضروف الحاد غير الضاغط مقارنةً بالأفراد الأصحاء²⁹. يلعب IL-17 دورًا محوريًا في الالتهاب وتلف الأنسجة في أمراض المناعة الذاتية³⁰، ويعزز الاستجابة المناعية لـ IFN-γ³¹. وقد أُبلغ عن زيادة تلف الأنسجة الناتج عن IL-17 في فئران MRL/lpr³² والفئران المعرضة لأمراض المناعة الذاتية³³. يستطيع IL-4 تثبيط التعبير عن السيتوكينات الالتهابية (مثل IL-1β وTNFα) وتنشيط البلاعم³⁴. وقد أُفيد بأن التعبير عن mRNA الخاص بـ IL-4 كان مختلفًا في مجموعة NPE مقارنةً بـ IL-17 و IFN-γ في نفس الوقت؛ وكان التعبير عن mRNA الخاص بـ IFN-γ في مجموعة NPE أعلى بكثير من المجموعات الأخرى. لذا، قد يكون إنتاج الإنترفيرون غاما وسيطًا للاستجابة الالتهابية الناجمة عن إدخال الجسيمات النانوية. وقد أظهرت الدراسات أن الإنترفيرون غاما يُنتَج بواسطة أنواع متعددة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة من النوع الأول المنشطة، والخلايا القاتلة الطبيعية، والبلعميات الكبيرة^35،36، وهو سيتوكين رئيسي محفز للالتهاب يعزز الاستجابات المناعية³⁷.
تشير هذه الدراسة إلى أن الاستجابة المناعية الذاتية قد تكون متورطة في حدوث وتطور التهاب السحايا المخاطي. وقد وجد لوما وزملاؤه أن خصائص الإشارة لكل من التهاب السحايا المخاطي والزوائد الأنفية البارزة متشابهة في التصوير بالرنين المغناطيسي، وكلاهما يُظهر إشارة عالية في تسلسل T2W³⁸. وقد تأكد ارتباط بعض السيتوكينات ارتباطًا وثيقًا بحدوث التهاب السحايا المخاطي، مثل إنترلوكين-139. وأشار ما وزملاؤه إلى أن بروز الزوائد الأنفية لأعلى أو لأسفل قد يكون له تأثير كبير على حدوث وتطور التهاب السحايا المخاطي¹². وأفاد بوبيتشكو⁴⁰ وهيرزباين وزملاؤه⁴¹ أن الزوائد الأنفية نسيج متسامح مناعيًا لا يمكنه دخول الدورة الدموية منذ الولادة. وتُدخل بروزات الزوائد الأنفية أجسامًا غريبة إلى مجرى الدم، مما يؤدي إلى حدوث تفاعلات مناعية ذاتية موضعية⁴². ويمكن لهذه التفاعلات المناعية الذاتية أن تحفز عددًا كبيرًا من العوامل المناعية، وعندما تتعرض هذه العوامل باستمرار للأنسجة، فإنها قد تُسبب تغيرات في الإشارات⁴³. في هذه الدراسة، يُعدّ فرط التعبير عن الإنترلوكين-4، والإنترلوكين-17، والإنترفيرون غاما من العوامل المناعية النموذجية، مما يُثبت العلاقة الوثيقة بين الخلايا البلعمية الكبيرة والخلايا البدينة. يُحاكي هذا النموذج الحيواني بدقة اختراق الخلايا البلعمية الكبيرة ودخولها إلى الصفيحة النهائية. وقد كشفت هذه العملية أيضًا عن تأثير المناعة الذاتية على الخلايا البدينة.
كما هو متوقع، يوفر لنا هذا النموذج الحيواني منصة محتملة لدراسة التغيرات النسيجية. مع ذلك، لا يزال لهذا النموذج بعض القيود: أولًا، خلال مرحلة مراقبة الحيوانات، يتطلب الأمر التضحية ببعض الأرانب في المراحل المتوسطة لإجراء اختبارات الأنسجة والبيولوجيا الجزيئية، ما يؤدي إلى استبعاد بعض الحيوانات من الدراسة بمرور الوقت. ثانيًا، على الرغم من تحديد ثلاث نقاط زمنية في هذه الدراسة، إلا أننا للأسف لم نقم بنمذجة سوى نوع واحد من التغيرات النسيجية (تغير موديك من النوع الأول)، وهو ما لا يكفي لتمثيل عملية تطور المرض لدى الإنسان، ويلزم تحديد المزيد من النقاط الزمنية لمراقبة جميع تغيرات الإشارات بشكل أفضل. ثالثًا، يمكن بالفعل إظهار التغيرات في بنية الأنسجة بوضوح من خلال التلوين النسيجي، ولكن بعض التقنيات المتخصصة يمكنها الكشف بشكل أفضل عن التغيرات المجهرية في هذا النموذج. على سبيل المثال، استُخدم المجهر الضوئي المستقطب لتحليل تكوين الغضروف الليفي في الأقراص الفقرية للأرانب.⁴⁵ تتطلب الآثار طويلة المدى لالتهاب النواة اللبية على التغيرات النسيجية والصفائح النهائية مزيدًا من الدراسة.
تم تقسيم أربعة وخمسين أرنبًا أبيضًا نيوزيلنديًا ذكرًا (يتراوح وزنها بين 2.5 و3 كيلوغرامات، وأعمارها بين 3 و3.5 أشهر) عشوائيًا إلى ثلاث مجموعات: مجموعة العمليات الوهمية، ومجموعة زرع العضلات (مجموعة ME)، ومجموعة زرع جذور الأعصاب (مجموعة NPE). وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تيانجين، ونُفذت الطرق التجريبية وفقًا للإرشادات المعتمدة.
أُدخلت بعض التحسينات على التقنية الجراحية التي وضعها س. سوباجيما 46. وُضع كل أرنب في وضعية الاستلقاء الجانبي، وكُشف السطح الأمامي لخمسة أقراص بين فقرات قطنية متتالية باستخدام مدخل خلفي جانبي خلف الصفاق. خضع كل أرنب للتخدير العام (20% يوريثان، 5 مل/كغ عبر وريد الأذن). أُجري شق جلدي طولي من الحافة السفلية للأضلاع إلى حافة الحوض، على بُعد 2 سم أمام عضلات الفقرات. كُشف العمود الفقري الأمامي الجانبي الأيمن من الفقرة القطنية الأولى (L1) إلى الفقرة القطنية السادسة (L6) عن طريق تشريح حاد وكليل للأنسجة تحت الجلد والأنسجة خلف الصفاق والعضلات (الشكل 6أ). حُدد مستوى القرص باستخدام حافة الحوض كمعلم تشريحي لمستوى القرص بين الفقرتين القطنيتين الخامسة والسادسة (L5-L6). استخدم إبرة ثقب قياس 16 لعمل ثقب بالقرب من الصفيحة النهائية للفقرة القطنية الخامسة (L5) بعمق 3 مم (الشكل 6ب). استخدم محقنة سعة 5 مل لسحب النواة اللبية الذاتية من القرص الفقري بين الفقرتين القطنيتين الأولى والثانية (L1-L2) (الشكل 6ج). أزل النواة اللبية أو العضلة حسب متطلبات كل مجموعة. بعد تعميق الثقب، ضع خيوطًا جراحية قابلة للامتصاص على اللفافة العميقة واللفافة السطحية والجلد، مع الحرص على عدم إتلاف السمحاق المحيط بجسم الفقرة أثناء الجراحة.
(أ) يتم كشف القرص الفقري L5-L6 عبر مدخل خلف الصفاق من الجهة الخلفية الجانبية. (ب) يتم استخدام إبرة قياس 16 لحفر ثقب بالقرب من الصفيحة النهائية للفقرة L5. (ج) يتم استئصال الخلايا الليفية العضلية الذاتية.
تم إعطاء التخدير العام باستخدام 20٪ يوريثان (5 مل/كجم) عن طريق الوريد الأذني، وتم تكرار صور الأشعة السينية للعمود الفقري القطني بعد 12 و 16 و 20 أسبوعًا من الجراحة.
تم تضحية الأرانب بحقن الكيتامين (25.0 ملغم/كغم) عضليًا، وبنتوباربيتال الصوديوم (1.2 غ/كغم) وريديًا، وذلك بعد 12 و16 و20 أسبوعًا من الجراحة. أُزيل العمود الفقري بالكامل لإجراء التحليل النسيجي والتحليل الكمي. استُخدمت تقنية النسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) وتقنية التلطيخ الغربي للكشف عن التغيرات في العوامل المناعية.
أُجريت فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي على الأرانب باستخدام جهاز رنين مغناطيسي سريري بقوة 3.0 تسلا (GE Medical Systems، فلورنسا، كارولاينا الجنوبية) مزود بجهاز استقبال ملف طرفي متعامد. تم تخدير الأرانب باستخدام اليوريثان بتركيز 20% (5 مل/كغ) عبر وريد الأذن، ثم وُضعت في وضعية الاستلقاء على الظهر داخل جهاز الرنين المغناطيسي مع تركيز منطقة أسفل الظهر على ملف سطحي دائري قطره 5 بوصات (GE Medical Systems). تم الحصول على صور موضعية مرجحة T2 في المستوى الإكليلي (TR، 1445 مللي ثانية؛ TE، 37 مللي ثانية) لتحديد موقع القرص القطني من L3-L4 إلى L5-L6. تم الحصول على شرائح مرجحة T2 في المستوى السهمي بالإعدادات التالية: تسلسل صدى الدوران السريع مع زمن تكرار (TR) 2200 مللي ثانية وزمن صدى (TE) 70 مللي ثانية، مصفوفة؛ مجال رؤية 260 وثمانية محفزات؛ سُمك القطع 2 مم، والمسافة بين الشرائح 0.2 مم.
بعد التقاط الصورة الأخيرة وقتل الأرنب الأخير، أُزيلت الأقراص الوهمية، والأقراص المضمنة في العضلات، وأقراص النواة اللبية لإجراء الفحص النسيجي. ثُبِّتت الأنسجة في محلول فورمالين متعادل مخفف بنسبة 10% لمدة أسبوع، ثم أُزيلت منها الكالسيوم باستخدام حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك، وقُطِّعت إلى شرائح بارافينية. دُمجت كتل الأنسجة في البارافين وقُطِّعت إلى شرائح سهمية (بسماكة 5 ميكرومتر) باستخدام الميكروتوم. صُبغت الشرائح بالهيماتوكسيلين والإيوسين.
بعد جمع الأقراص الفقرية من الأرانب في كل مجموعة، تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي باستخدام عمود UNIQ-10 (شركة شنغهاي سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، ونظام النسخ العكسي ImProm II (شركة بروميج، ماديسون، ويسكونسن، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم أُجريت عملية النسخ العكسي.
أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) باستخدام جهاز Prism 7300 (شركة Applied Biosystems، الولايات المتحدة الأمريكية) ومزيج SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (شركة Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كان حجم تفاعل البوليميراز المتسلسل 20 ميكرولترًا، ويحتوي على 1.5 ميكرولتر من الحمض النووي المكمل المخفف و0.2 ميكرومول من كل بادئ. صُممت البادئات بواسطة برنامج OligoPerfect Designer (شركة Invitrogen، فالنسيا، كاليفورنيا) وصُنعت بواسطة شركة Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (الصين) (الجدول 1). استُخدمت ظروف التدوير الحراري التالية: خطوة تنشيط البوليميراز الأولية عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم 40 دورة، كل دورة 15 ثانية عند 94 درجة مئوية لفصل الحمض النووي، ثم التلدين لمدة دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية، ثم الاستطالة، وأُجريت قياسات التألق لمدة دقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية. تم تضخيم جميع العينات ثلاث مرات، واستُخدم متوسط ​​القيم في تحليل RT-qPCR. وتم تحليل بيانات التضخيم باستخدام جهاز FlexStation 3 (Molecular Devices، ساني فيل، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). وتمت معايرة التعبير الجيني لـ IL-4 وIL-17 وIFN-γ باستخدام الجين المرجعي الداخلي (ACTB). وحُسبت مستويات التعبير النسبي للـ mRNA المستهدف باستخدام طريقة 2-ΔΔCT.
تم استخلاص البروتين الكلي من الأنسجة باستخدام جهاز تجنيس الأنسجة في محلول تحلل RIPA (يحتوي على مزيج من مثبطات البروتياز والفوسفاتاز)، ثم تم طرده مركزيًا بسرعة 13000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة بقايا الأنسجة. تم تحميل 50 ميكروغرامًا من البروتين في كل حارة، وفصلها باستخدام هلام بولي أكريلاميد SDS بنسبة 10%، ثم نقلها إلى غشاء PVDF. تم إجراء عملية الحجب باستخدام 5% من الحليب المجفف الخالي من الدسم في محلول ملحي منظم بالتروميثامين (TBS) يحتوي على 0.1% من توين 20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تحضين الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية المضادة للديكورين (مخففة بنسبة 1:200؛ بوستر، ووهان، الصين) (مخففة بنسبة 1:200؛ بيوس، بكين، الصين) طوال الليل عند 4 درجات مئوية، وتمت إعادة التفاعل في اليوم التالي. باستخدام الأجسام المضادة الثانوية (غلوبولين مناعي G مضاد للأرانب من الماعز بتخفيف 1:40,000) مع بيروكسيداز الفجل (بوستر، ووهان، الصين) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن إشارات لطخة ويسترن من خلال زيادة التلألؤ الكيميائي على الغشاء المتألق كيميائيًا بعد التعريض للأشعة السينية. ولتحليل الكثافة الضوئية، تم مسح اللطخات ضوئيًا وقياسها كميًا باستخدام برنامج BandScan، وعُبِّر عن النتائج كنسبة التفاعل المناعي للجين المستهدف إلى التفاعل المناعي للتوبولين.
أُجريت الحسابات الإحصائية باستخدام برنامج SPSS 16.0 (SPSS، الولايات المتحدة الأمريكية). عُبِّرت البيانات التي جُمعت خلال الدراسة كمتوسط ​​± انحراف معياري (متوسط ​​± انحراف معياري)، وحُلِّلت باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه للقياسات المتكررة (ANOVA) لتحديد الفروق بين المجموعتين. واعتُبرت قيمة P < 0.05 دالة إحصائيًا.
وبالتالي، فإن إنشاء نموذج حيواني لمرض MC عن طريق زرع الجسيمات النانوية الذاتية في جسم الفقرة وإجراء الملاحظة التشريحية الكلية وتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي والتقييم النسيجي والتحليل البيولوجي الجزيئي قد يصبح أداة مهمة لتقييم وفهم آليات مرض MC البشري وتطوير تدخلات علاجية جديدة.
كيفية الاستشهاد بهذه المقالة: هان، سي. وآخرون. تم إنشاء نموذج حيواني لتغيرات موديك عن طريق زرع النواة اللبية الذاتية في العظم تحت الغضروفي للعمود الفقري القطني. تقارير علمية 6، 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. التصوير بالرنين المغناطيسي للعمود الفقري القطني: انتشار فتق القرص واحتباسه، وانضغاط جذر العصب، وتشوهات الصفيحة النهائية، وهشاشة العظام في مفاصل الوجيهات لدى متطوعين لا يعانون من أعراض. ​​Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
كير، ب.، كورشولم، ل.، بنديكس، ت.، سورنسن، ج.س.، وليبوف-إيد، ك. التغيرات الموديكية وعلاقتها بالنتائج السريرية. المجلة الأوروبية للعمود الفقري: المنشور الرسمي للجمعية الأوروبية للعمود الفقري، والجمعية الأوروبية لتشوهات العمود الفقري، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري العنقي 15، 1312-1319، doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
كويزما، م.، وآخرون. التغيرات الموديكية في الصفائح النهائية للفقرات القطنية: الانتشار والارتباط بألم أسفل الظهر وعرق النسا لدى العمال الذكور في منتصف العمر. مجلة العمود الفقري 32، 1116-1122، doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
دي روس، أ.، كريسيل، هـ.، سبريتزر، ك.، ودالينكا، م. التصوير بالرنين المغناطيسي لتغيرات نخاع العظم بالقرب من الصفيحة النهائية في الأمراض التنكسية للعمود الفقري القطني. المجلة الأمريكية للأشعة 149، 531-534، doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
موديك، إم تي، شتاينبرغ، بي إم، روس، جيه إس، ماساريك، تي جيه، وكارتر، جيه آر. مرض القرص التنكسي: تقييم تغيرات نخاع الفقرات باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي. علم الأشعة 166، 193-199، doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
موديك، إم تي، ماساريك، تي جيه، روس، جيه إس، وكارتر، جيه آر. تصوير مرض القرص التنكسي. علم الأشعة 168، 177-186، doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
جينسن، تي إس، وآخرون. مؤشرات تغيرات إشارة الصفيحة النهائية للفقرات الجديدة (موديك) لدى عامة السكان. المجلة الأوروبية للعمود الفقري: المنشور الرسمي للجمعية الأوروبية للعمود الفقري، والجمعية الأوروبية لتشوهات العمود الفقري، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري العنقي، القسم 19، 129-135، doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
ألبرت، إتش بي ومانيش، ك. التغيرات الموديكية بعد فتق القرص القطني. المجلة الأوروبية للعمود الفقري: المنشور الرسمي للجمعية الأوروبية للعمود الفقري، والجمعية الأوروبية لتشوه العمود الفقري، والجمعية الأوروبية لأبحاث العمود الفقري العنقي 16، 977-982، doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
كيرتولا، ل.، لوما، ك.، فيماس، ت.، جرونبلاد، م.، وكابا، إ. يمكن لتغيرات موديك من النوع الأول أن تتنبأ بالتنكس القرصي التشوهي سريع التقدم: دراسة مستقبلية لمدة عام واحد. المجلة الأوروبية للعمود الفقري 21، 1135-1142، doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
هو، زد جي، تشاو، إف دي، فانغ، إكس كيو، وفان، إس دبليو. التغيرات الموديكية: الأسباب المحتملة ومساهمتها في تنكس القرص القطني. فرضيات طبية 73، 930-932، doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
كروك، إتش في. تمزق القرص الداخلي. مشاكل انزلاق القرص على مدى 50 عامًا. العمود الفقري (فيلادلفيا، بنسلفانيا 1976) 11، 650-653 (1986).